鞘内注射LY294002缓解大鼠骨癌痛

网络出版时间：2014-12-4 13:45网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.025.html

鞘内注射LY294002缓解大鼠骨癌痛

金迪,杨建平,胡计嬅,王丽娜

(苏州大学附属第一医院麻醉科，江苏 苏州215006)

中国图书分类号：R-332；R322.81；R441.1；R345.57；R452；R738.1；R977.3

摘要:目的观察鞘内注射(intrathecal injection，i.t.)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002对骨癌痛大鼠疼痛行为学、脊髓背角磷酸化Akt(p-Akt)表达的影响。方法♀ SD大鼠40只，体质量180~200 g，随机分为5组(n=8)：假手术组(Ⅰ组)、假手术+LY294002组(Ⅱ组)、骨癌痛组(Ⅲ组)、骨癌痛+二甲基亚砜(DMSO)组(IV组)、骨癌痛+LY294002(V组),于大鼠左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞构建胫骨癌痛模型。术后d 7~9鞘内连续注射浓度为2.5 g·L`(-1)的LY294002 10μL或10μL的5%DMSO。观测术前及术后d 7给药后每小时机械痛阈(至8 h)。术后d 9处死大鼠，取各组大鼠的L4~6脊髓组织进行免疫组化染色，检测脊髓背角PI3K活化标志p-Akt的表达。结果骨癌痛组大鼠(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组)机械痛阈(MWT)明显低于假手术组(Ⅰ组)(P<0.01)，V组在给药后2~4h痛阈明显升高(P<0.05)，3 h达到峰值(P<0.01)。与Ⅰ组比较，Ⅲ、Ⅳ组脊髓背角p-Akt阳性细胞数明显增加，p-Akt表达增多(P<0.01)。与Ⅲ、Ⅳ组比较，Ⅴ组鞘内注射LY294002后能明显降低脊髓背角p-Akt的表达(P<0.05)。结论PI3K/Akt通路可能参与大鼠骨癌痛的发生。

关键词:骨肿瘤；疼痛；1-磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶；小胶质细胞；脊髓；信号通路

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.025

文章编号：

文献标志码：A1001-1978(2015)01-0118-04

收稿日期：2014-09-02 修回日期：2014-11-08

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81171057，81000479)；江苏省自然科学基金(No BK2011305)；江苏省临床医学科技专项(No BL2012024)

作者简介：金迪(1989-),女，硕士，研究方向：麻醉学(疼痛),E-mail：kame_jindi@163.com;

通讯作者杨建平(1957-)，男，博士，博士生导师，研究方向：麻醉学(疼痛),,E-mail：szyangjp@hotmail.com

Abstract:AimTo investigate the effect of intrathecal injection of PI3K inhibitor LY294002 on pain behaviour and expression of p-Akt in spinal dorsal horns in bone cancer pain(BCP) rats. MethodsForty female SD rats weighing 180~200g were randomly divided into five groups (n=8 each):(Ⅰ)sham group;(Ⅱ)sham+LY294002 group;(Ⅲ)BCP group;(Ⅳ)BCP+DMSO group;(V)BCP+LY294002 group. BCP rat model was induced by inoculating Walker 256 mammary gland carcinoma cells into the medullary cavity of the left tibia.Rats received i.t.injections of either PI3K inhibitor LY294002 10μL(2.5g·L`(-1))or 5%DMSO 10 μL at the time of d 7~9 after the operation. Mechanical withdrawal threshold(MWT) test was performed before and after i.t.injections on d7(till 8h).The rats were sacrificed after inoculation and the L4~6 segments of the spinal cords were removed for immunohistochemistry to determinate the expression changes of spinal p-Akt.ResultsCompared with I group,the rats in Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ group showed obvious mechanical hyperalgesia.The MWT of V group increased apparently from 2nd hour to 4th hour(P<0.05),and reached the peak in 3rd hour(P<0.01). Compared with I group,the expression of p-Akt in the spinal cord in Ⅲ,Ⅳ group increased obviously(P<0.01).Compared with Ⅲ,Ⅳ group,i.t.injections of LY294002 obviously cut down the expression of p-Akt in the spinal cord(P<0.05).ConclusionPI3K/Akt singaling pathway may take part in the development of bone cancer pain.

癌性痛是一种病理性疼痛，而骨癌痛又是癌性痛中最主要的一种。既往的研究观察到，高达85%的肺、乳腺、前列腺癌症患者都存在骨转移，三分之一的患者都有骨痛症状[1]。虽然骨癌痛严重影响患者的生活质量，但由于其发生机制尚未明了，临床治疗效果不佳。研究发现，PI3K/Akt信号通路参与神经病理痛[2-3]和炎性痛的发生[4-6]，但其是否参与骨癌痛的发生发展尚未可知。本研究拟通过构建大鼠胫骨癌痛模型，鞘内给予PI3K抑制剂LY294002后观察大鼠机械痛阈、脊髓p-Akt表达情况，探讨骨癌痛发生的脊髓机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器Walker256细胞(南京中医药大学新药与海洋药物研究中心药理毒理研究室惠赠)，PI3K抑制剂LY294002(Calbiochem，美国)，兔抗p-Akt一抗(Cell Signaling，美国)，SP试剂盒(北京中杉生物，中国)，DAB显色试剂盒(北京中杉生物，中国)，照相机Olympus-C7070wz(Olympus，日本)，倒置显微镜Olympus-CKX41(Olympus，日本)，von-frey针刺触觉测量仪(stoelting，美国)。

2结果

2.1机械痛阈测定结果各组大鼠的MWT基础值差异均无统计学意义(P>0.05)。Ⅰ，Ⅱ组大鼠d 7 MWT值比较差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅲ，Ⅳ组大鼠d 7 MWT值均低于Ⅰ组(P<0.01)，且该两组间MWT值差异亦无统计学意义(P>0.05)。与Ⅲ组比较，术后d 7给药后V组大鼠2~4 h的MWT值差异有统计学意义(P<0.05)，给药后3 h达到峰值(P<0.01),见Fig 1,2。

Fig 1The MWT of rats in all groups before

**P<0.01vsI group(d7)

Fig 2Effect of PI3K inhibitor LY294002 on MWT

*P<0.05，**P<0.01vsⅠ group,#P<0.05，##P<0.01vsⅢ group

2.2免疫组化染色结果与Ⅰ组比较，术后d 9，Ⅲ组、Ⅳ组和V组大鼠脊髓背角p-Akt阳性细胞数增加，表达上调(P<0.01)；与Ⅲ组和Ⅳ组比较，Ⅴ组脊髓背角p-Akt阳性细胞数降低，表达下调(P<0.01)；Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组p-Akt的阳性细胞数及表达比较差异无统计学意义(P<0.01)，见Fig 3，Tab 1。

Tab 1Effect of PI3K inhibitor LY294002 on

GroupNumMODⅠ13.63±2.670.011±0.0058Ⅱ13.75±3.010.012±0.0053Ⅲ64.25±5.57**0.047±0.0078**Ⅳ65.38±10.65**0.046±0.0072**Ⅴ37.25±6.79**##0.024±0.0089*##

*P<0.05，**P<0.01vsⅠ or Ⅱ group;##P<0.01vsⅢ or Ⅳ group

3讨论

本研究建立的胫骨癌痛模型是目前进行癌痛研究的常用模型[7]，能模拟人类骨癌痛基本特征，且造模技术纯熟，模型稳定。本研究在造模后d 7，造模大鼠出现机械痛阈降低，且活动度下降，提示胫骨癌痛模型已建立。

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一种可使肌醇环D-3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，哺乳类的PI3K可分为3个亚型：Class I、ClassII和ClassIII，能激活下游Akt的是ClassI亚型。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于AGC蛋白激酶家族。PI3K活化后与Akt结合，使Akt从胞液转移至胞膜内侧，同时引起其构象变化并发生磷酸化，即磷酸化Akt(p-Akt)[10-12]，因此Akt是PI3K信号通路中的中心环节，p-Akt常作为PI3K活化的标志[13-14]。

既往研究证明，PI3K/Akt信号通路参与了慢性疼痛的发生和发展。在神经病理痛大鼠模型上，身体同侧背根神经节和脊髓背角的p-Akt阳性神经元明显增加，而鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin或LY294002，以及Akt抑制剂IV或(-)-鱼藤素可以明显缓解大鼠的机械痛敏[2]。此外，Guedes等[3]发现，在坐骨神经横断术(sciatic nerve transection ，SNT)后7 d，总Akt和p-Akt的表达均增高。在皮内注射辣椒素构建的炎性痛模型中，p-Akt在腰段脊髓背角和背根神经节的表达都明显增高[4,15]，而预先给予PI3K抑制剂则可以预防由辣椒素引起的大鼠的机械痛敏，且Wortmannin和LY294002这两种PI3K的抑制剂均对此有效[4,15]。Pezet等[6]还发现，鞘内给予LY294002后可以缓解由足底注射福尔马林引发的炎性痛，该作用有剂量依赖性，且对第一时相和第二时相的炎性痛均有缓解作用。

本实验研究观察，骨癌痛造模成功的大鼠产生明显的机械痛觉超敏，脊髓背角L4~6水平的p-Akt表达增加，PI3K/Akt通路被激活；而连续3 d鞘内给予PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后，脊髓p-Akt表达降低，PI3K/Akt活化受到抑制。术后7 d的MWT值显示，大鼠已产生的机械痛觉过敏，在鞘内注射LY294002后2~4 h被部分逆转，骨癌痛得到部分缓解，3 h时达到峰值。因此我们有理由推测，大鼠骨癌痛模型中脊髓水平PI3K/Akt信号通路得到激活，且主要在骨癌痛早期发生作用。

Fig 3Different expressions of p-Akt in spinal dorsal horn in rats Intrathecal LY294002 significantly decreased the expression of p-Akt in BCP rats.Scale Bar:50μm.

综上所述，脊髓PI3K/Akt信号通路的激活可能参与了大鼠骨癌痛的形成。

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Intrathecal injection of LY294002 attenuates bone cancer pain

JIN Di, YANG Jian-ping, HU Ji-hua, WANG Li-na

(DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

Key words: bone neoplasms; pain; 1-phosphatidylinositol 3-kinase;protein-serine-threonine kinases; microglia;spinal cord;signaling pathway