两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞向脂肪细胞分化的比较

研究报告

两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞向脂肪细胞分化的比较

曹蕊，吕涛，严笠，孙雪健，肖苒

(中国医学科学院整形外科医院研究中心，北京100144)

【摘要】目的比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell, ADSC)的成脂分化能力，探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案。方法提取3例临床患者的脂肪干细胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(rADSCs)，将hADSCs、rADSCs分别接种于六孔板，分为未诱导组、成脂诱导I组和II组，分别使用普通培养基、成脂诱导培养基I和II，培养10 d后以油红O染色，镜下观察及检测490 nm吸光度值(A490)，比较脂滴形成情况。结果未诱导的hADSCs和rADSCs均呈成纤维细胞样生长，成脂诱导培养3 d后出现脂滴；油红O染色显示，成脂诱导组脂滴呈橘红色，hADSCs和rADSCs的成脂诱导II组形成的脂滴均明显大于诱导I组，统计学分析显示hADSCs的成脂诱导II组测得的A490明显高于诱导I组(P<0.01); 而两组的rADSCs的A490无明显差异(P>0.05)。结论 hADSCs和rADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化，但成脂诱导II组优于成脂诱导I组。

【关键词】人脂肪干细胞；大鼠脂肪干细胞；成脂诱导

[基金项目]国家自然科学基金(编号:81171817 / 30871433)。

[作者简介]曹蕊 (1966- )，女，主管技师,研究方向：细胞生物学。E-mail: caorui660428@sina.com。

[通讯作者]肖苒 (1971-)， 女，教授，研究方向：干细胞与组织工程基础及应用研究E-mail: rxiao163@163.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.005

Comparison of adipogenic differentiation ability of adipose stem

cells derived from humans and rats using two kinds of

adipogenic culture media

CAO Rui, LV Tao,YAN Li, SUN Xue-Jian, XIAO Ran

(Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical

Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China)

Abstract【】ObjectiveTo find a more appropriate method of adipogenic induction for adipose stem cells derived from humans and rats by comparing their adipogenic differentiation ability using two kinds of adipogenic culture media. Methods The human adipose stem cells (hADSCs) were extracted from lipoaspirates of 3 donors in the clinic, and the rat adipose stem cells (rADSCs) were obtained from adipose tissues of 6-week old rats. The cells were plated into two 6-well plates, and were divided into 3 groups: the negative control group, adipogenic induction group I and group II, respectively, two wells in each group. The control medium, adipogenic induction medium I and medium II were added into the cells of different groups, respectively. After induction for 10 days, the adipogenic differentiation ability of cells was assessed under microscope with oil red O staining and detecting the optical density value of 490 nm (A 490 nm) to compare the lipid droplet formation in the cells. Results The hADSCs and rADSCs showed a fibroblast-like growth. Positive oil red O staining cells showed orange lipid in the cells of adipogenic induction group from the third day of culture. The amount of lipid in cells induced by adipogenic induction medium II was higher than that in cells induced by adipogenic induction medium I, the A490 nm optical density of hADSCs induced by adipogenic induction medium II was significantly higher than that induced by adipogenic induction medium I (P<0.01), but there was no significant difference between the rADSCs induced by adipogenic induction medium I and II (P>0.05). ConclusionsBoth hADSCs and rADSCs can be induced to adipogenic differentiation using the two kinds of induction media, however, the induction of adipogenic differentiation ability of the adipogenic induction medium II is stronger than that of the adipogenic induction medium I.

【Key words】Adipose derived stem cells, humam; Adipose derived stem cells, rat;Adipogenic differentiation; Cell culture

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的间充质干细胞，多项研究已证实ADSCs有很强的自我复制和多向分化的潜能，能被诱导分化为骨、软骨、脂肪等多种细胞，并且取材方便，能在体外大量扩增，与骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)相比，ADSCs更易获得足够的细胞数量且对患者损伤小，是更理想的间充质干细胞源，在组织工程和临床治疗中具有很大的应用潜能[1]。本实验通过对hADSCs和rADSCs在两种成脂诱导培养基中成脂分化能力进行比较，为脂肪干细胞成脂诱导提供更理想的诱导方法。

1材料和方法

1.1实验对象

人脂肪干细胞来源于3例女性临床吸脂患者，平均年龄35岁。大鼠脂肪干细胞来源于出生6周的SD大鼠，本实验用SD大鼠来自中国人民解放军军事医学科学院动物中心,许可证号SCXK-(军)2012-0004。

1.2主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、青链霉素(Hyclone)、I型胶原酶(Sigma)、胰蛋白酶(Hyclone)、罗格列酮(Sigma)、生物素(Sigma)、泛酸(Sigma)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(Sigma)、胰岛素(Sigma)、吲哚美辛(Sigma)、地塞米松(Sigma)。主要仪器：二氧化碳孵箱、倒置显微镜、酶标仪。

1.3培养基配方

普通完全培养基：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青链霉素。成脂诱导培养基Ⅰ(100 mL)[1]：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青链霉素、IBMX 0.5 mmol/L、胰岛素 10 μmol/L、吲哚美辛 200 μM、地塞米松10 nmol/L。成脂诱导培养II (100 mL)[7]：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青链霉素、 胰岛素1 μmol/L、IBMX 0.5 mmol/L、地塞米松20 nmol/L、罗格列酮5 μmol/L、生物素33 μmol/L、泛酸17 μmol/L。

1.4实验方法

1.4.1大鼠ADSCs体外分离培养：取出生6周的SPF级SD大鼠数只，颈椎脱臼处死后，浸于75%酒精消毒10 min，解剖切取双侧腹股沟皮下脂肪垫，放入含有1%青-链霉素的PBS中，剔除小血管及筋膜，再将脂肪组织剪成1 mm3小块，用PBS洗3遍后，加入等体积0.1% I型胶原酶溶液，在摇床上37℃消化(30～40)min，加入含10% FBS低糖DMEM终止消化，轻轻吹打数次混匀，以1 000 r/min离心5 min，弃去上层油脂及上清液，加入适量PBS吹打离心管中的沉淀物，再以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，以含10% FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞后，接种于培养皿中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，(24～48)h首次换液，以后每3 d换液1次并在倒置显微镜下观察细胞状态及生长情况。

1.4.2人ADSCs体外分离培养:将人脂肪抽吸组织用无菌的PBS冲洗3遍，洗去血液和麻药，记录剩余组织的体积，在其中加入终浓度为0.75 g/L的I型胶原酶，37℃消化30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，中和胶原酶的消化作用，1 000 rpm/min离心5 min，弃上清液，加入培养基重悬细胞，将细胞悬液分装入培养皿，37℃、5%的CO2条件下培养。24 h后全量换液，去除未贴壁的细胞，以后每3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态。

1.4.3成脂诱导及检测：将第3代的hADSCs、rADSCs分别以5×104/孔各接种一个六孔板，孵育24 h后将每块六孔板分3组(2孔一组)，分别为未诱导组、成脂诱导I组和成脂诱导II组，待细胞长到70%时，分别换成普通培养基、成脂诱导培养基I和成脂诱导培养基II，3 d换液1次。培养10 d后进行油红O染色并采用分光光度计检测490 nm时的吸光度值，对hADSCs、rADSCs用两种不同诱导方法进行成脂诱导后分化能力进行比较。

1.4.4油红O染色具体步骤：在成脂诱导10 d后将培养皿中培养基吸出，用PBS洗两遍后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，吸出固定液后加入油红O染液，室温孵育20 min，用60%异丙醇快速洗1遍，然后再用蒸馏水洗2遍。显微镜下观察细胞成脂分化情况。以异丙醇溶解染色后的成脂细胞，摇床振荡10 min，490 nm测吸光度。

1.4.5统计学方法:采用SPSS (Version 17.0)软件，用独立样本t检验(Independent-Samplesttest)对检测结果进行统计学分析，当P<0.05时认为差异有统计学意义。数据以均数±标准差(mean ± s)表示。

2结果

2.1原代及传代细胞镜下观察

细胞最初接种时呈圆形透亮的单个细胞悬浮于培养液中，24 h后部分已贴壁，呈短梭形，(2～3)d贴壁细胞逐渐增多，形成许多大小不等的集落，向四周扩散，细胞逐渐呈长梭形或多角形，(6～7)d集落中细胞数量增加，集落之间互相融合，逐渐铺满瓶底后，可进行传代，传代细胞增殖迅速，(2～4)h开始贴壁，24 h完全贴壁，(3～5)d可达80%汇合(图1，见文后彩插4)。

2.2hADSCs成脂诱导分化结果

未诱导组无脂滴形成，两成脂诱导组细胞均有不同程度的橙红色脂滴形成，成脂诱导II组中细胞形成的脂滴明显多于成脂诱导I组，并且脂滴大且饱满，吸光度测试后统计学分析也表明成脂诱导液I和成脂诱导液II诱导细胞分化能力差异存在显著性 (P<0.01)，因此成脂诱导II组细胞分化能力明显优于成脂诱导I组(图2见文后彩插4，图3)。

2.3rADSCs成脂诱导分化结果

细胞分别在普通培养基、成脂诱导培养基I和成脂诱导培养基II中培养10 d后进行油红O染色，镜下观察未诱导组无脂滴形成。两诱导组细胞均有脂滴形成，成脂诱导II组细胞形成的脂滴较成脂诱导I组的脂滴大且饱满；吸光度测试后统计学分析表明两种诱导液中rADSCs成脂分化差异无显著性(P>0.05)(见图2,图3)。

图3　hADSCs、rADSCs成脂诱导10 d 后油红O染色吸光度值比较 Fig.3　Comparison of the A490 nm optical density of hADSCs and rADSCs at 10 days after adipogenic induction. Oil red O staining

3讨论

人和大鼠的脂肪组织均可分离脂肪干细胞，人脂肪组织通常来源于吸脂术，大鼠脂肪组织则取自腹股沟处的脂肪垫。有文献报道在从脂肪组织中分离出的原代基质细胞中，成纤维样细胞在数量上占有优势，但仍混有少量的造血细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。通过传代，混杂细胞的比例迅速降低，传至第3代时可以得到较纯的脂肪干细胞(ADSCs)[2]。在体外培养过程中，ADSCs可以在很长时间内保持未分化状态，具有成纤维细胞样形态，胞内缺乏脂滴，但具有多向分化的潜能。体外培养hADSCs、rADSCs的过程中，随着传代培养，细胞形态由原代的不均一状态逐渐形成均一的梭形，贴壁生长的细胞保持较为稳定的生物性状，具有较强的增殖能力。经3代以上传代后，细胞成分均一，直至12代，纯度始终保持在95%以上，具有高度的同源性[3]，因此，本实验均采用第3代细胞进行下一步的成脂分化实验，这时的细胞生长旺盛，细胞状态好，形态均一。

本实验采用了两种成脂诱导培养基，诱导培养基I是比较经典的成脂诱导配方[1]，培养成分包括地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、吲哚美辛。研究显示胰岛素可以显著提高细胞中甘油三酯合成和聚集的速率[4]；地塞米松属于糖皮质激素，可以促进脂肪前体细胞的成脂分化[5]；IBMX是cAMP的非特异性抑制剂，而吲哚美辛属于非甾体抗炎药，可以抑制前列腺素合成，二者可以启动成脂分化[6]。本实验中又参考另一文献[7]提供的配方配制了成脂诱导培养基II，配方中除有地塞米松、IBMX、胰岛素外还包括泛酸、生物素及罗格列酮，其中的罗格列酮与PPAR受体结合增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性。泛酸和生物素是维生素B族，在脂肪合成过程中起重要作用[8]。在既往研究中，有研究者应用与成脂诱导培养基II成分类似的成脂诱导培养基诱导前脂肪细胞，采用不同诱导时间和步骤，导致不同的诱导效果[9]；也有研究者比较了与本实验中成脂诱导培养基成分不同的其它培养基诱导月经血干细胞的成脂分化能力[10]。采用本实验中成脂诱导培养基I和II分别诱导hADSCs和rADSCs的比较研究尚未见报道。将HADSCs分别用这两种诱导培养基诱导分化，培养10 d后油红O染色，镜下观察和吸光度检测均证实成脂诱导培养基II诱导细胞成脂分化能力明显好于成脂诱导培养基I，因此hADSCs更适宜用成脂诱导培养基Ⅱ诱导。rADSCs分别在两种诱导培养基中培养后虽然针对其油红O染色的吸光度检测结果经统计学分析表明成脂分化能力没有明显差异，但镜下观察细胞在成脂诱导培养基II中培养形成的脂滴较诱导培养基I中形成的脂滴更为饱满，脂滴团较大，比较而言rADSCs也适宜用成脂诱导培养基II诱导。因此，通过比较成脂诱导培养基II优于成脂诱导培养基I，更适宜hADSCs和rADSCs成脂诱导。

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〔修回日期〕2014-11-03