甘草体外抗呼吸道合胞病毒的作用及机制

甘草体外抗呼吸道合胞病毒的作用及机制

黄筱钧1

(湖北民族学院医学院，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探讨甘草体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用及初步机制。方法采用细胞病变效应(CPE)和MTT法，测定细胞半数中毒浓度(TC50)、药物半数抑制浓度(IC50)和抗病毒指数(TI)，以利巴韦林为对照，评价甘草抗RSV的效果。结果甘草在体外既能抑制RSV的增殖，又能直接杀伤RSV，阻断RSV的感染。甘草的TC50=3.21 mg/ml，IC50=0.273 mg/ml，TI=11.76。甘草比利巴韦林毒性小，抗病毒指数大，安全范围大，抗RSV作用与利巴韦林相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论甘草使用安全，在体外对RSV有明显的抑制作用。

关键词〔〕甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用

中图分类号〔〕R373.1；R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81360654)

1四川大学华西基础医学与法医学院

第一作者：黄筱钧(1979-)，男，讲师，主要从事分子病毒学和抗病毒中药研究。

Experimental study of anti-respiratory syncytial virus effect of Radix Glycyrrhizae in vitro

HUANG Xiao-Jun.

School of Medicine, Hubei Minzu University, Enshi 445000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of anti-respiratory syncytial virus (RSV)with Radix Glycyrrhizaet and the preliminary mechanism in vitro .MethodsThe antiviral activity of Radix Glycyrrhizae was tested with ribavirin as the positive control. Virus cytopathic effect (CPE) and methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method were used to measure half toxic concentration (TC50), half inhibitive concentration (IC50)and therapeutic index(TI).ResultsRadix Glycyrrhizae inhibited RSV infection in vitro. The TC50, IC50, TI were 3.21,0.273 mg/ml, 11.76 respectively. Radix Glycyrrhizae had small toxicity, large antiviral index and security range . The anti-RSV role was similar to the same dose of ribavirin(P>0.05).ConclusionsRadix Glycyrrhizae has a significant anti-RSV effect in vitro.

【Key words】Radix Glycyrrhizae ; Respiratory syncytial virus; Antiviral effect

甘草为豆科类植物，其主要有效成分是三萜皂苷类、黄酮类、生物碱和多糖，具有清热解毒、润肺止咳之功效，有解毒和祛痰作用。呼吸道合胞病毒(RSV)属于副黏病毒科肺炎病毒属，是引起3岁以下小儿呼吸道感染最重要的病原体，也是诱发婴儿早期喘息及毛细支气管炎的最常见病毒，同时也是导致免疫抑制人群和老年人群呼吸道感染和死亡的重要原因〔1，2〕。已有研究证实甘草黄酮具有明显的抗氧化、抗炎和抗变态反应、抗溃疡、镇痛、抗菌、抗肿瘤和较好的止痒作用〔3，4〕。本实验以人咽喉癌上皮细胞Hep-2细胞为细胞模型，对甘草醇提液体外抗RSV作用进行研究，并初步探讨其机制。

1材料与方法

1.1药物甘草购于恩施药材公司，为恩施道地药材，实验制备甘草醇提液1.0 g/ml，冷藏备用。利巴韦林注射液(100 mg/ml)，贵州天地药业责任有限公司生产(批号H20067579)。

1.2病毒RSV Long株，由四川大学华西医学中心提供。

1.3细胞Hep-2细胞为四川大学华西医学中心微生物学教研室保存。细胞生长液为10%FBS MEM液，细胞维持液为2%FBS MEM液。

1.4甘草的细胞毒性测定Hep-2细胞传代3次，生长呈单层，调整密度为1.0×104/ml。将甘草原液用细胞维持液倍比稀释，浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/ml，分别接种于Hep-2单层细胞中，0.1 ml/孔，每一稀释浓度重复4孔。用细胞维持液作为阴性对照，利巴韦林作阳性对照，37℃、5%CO2培养，每天观察细胞病变效应(CPE)采用MTT法，570 nm波长下测定吸光度(A值)。计算细胞存活率、甘草致细胞半数中毒浓度(TC50)。细胞存活率=(药物组平均A值/细胞对照组平均A值)×100%。

1.5RSV的毒力测定将RSV作10倍系列稀释，将不同稀释度的RSV接种于Hep-2单层细胞(0.1 ml/孔)，每一稀释度重复4孔，对照组Hep-2细胞加维持液，37℃、5%CO2孵育2 h，换细胞维持液。每天观察并记录CPE至CPE不再进展。按照Reed-Muench法计算病毒的半数细胞培养物感染量(TCID50)。

1.6甘草体外抗RSV作用

1.6.1甘草对RSV生物合成的影响将100TCID50RSV接种于Hep-2细胞(0.1 ml/孔)，37℃、5%CO2孵育2 h，用细胞生长液洗3次，洗去未结合的病毒。加入不同浓度的含药维持液(0.1 ml/孔)，37℃、5%CO2孵育72 h。采用MTT法测定药物作用于感染细胞后的病毒抑制率，计算甘草对RSV致Hep-2 CPE产生50%抑制的浓度，即药物的半数有效浓度(IC50)和抗病毒指数(TI)。TI=TC50/IC50。病毒抑制率=(实验组平均A值-病毒对照组平均A值)/(药物组平均A值-病毒对照组平均A值)×100%。

1.6.2甘草对RSV吸附的影响将不同浓度的甘草加入含单层Hep-2细胞的96孔板上，37℃吸附90 min，弃去上清液，用细胞生长液洗3次，加入100TCID50RSV，滴加细胞维持液1.0 ml/孔，37℃吸附90 min，弃去上清液，加细胞维持液，37℃、5%CO2中培养。逐日观察细胞生长情况，记录CPE。

1.6.3甘草对RSV的直接杀伤作用将不同浓度的甘草与100TCID50RSV等量混合后于37℃作用1 h，将混合液分别接种至长满单层Hep-2细胞的96孔培养板上(0.2 ml/孔)，37℃孵育1 h，用细胞培养液洗3次，洗去未结合的病毒及药物，再加细胞维持液1.0 ml，37℃、5%CO2培养72 h。每日观察细胞生长情况。

2结果

2.1甘草的细胞毒性甘草致Hep-2细胞CPE表现为细胞皱缩，形态改变，胞质颗粒增多，折光性增强。96 h后Hep-2细胞脱落，悬浮在培养液表面。随着甘草液浓度的增加，对Hep-2细胞的毒性增强，细胞存活率下降。MTT法测定甘草和利巴韦林的TC50分别为3.21 mg/ml和 0.293 mg/ml。甘草对细胞的毒性比利巴韦林小。

2.2RSV的毒力正常Hep-2细胞呈梭形，RSV接种于Hep-2细胞后第2天出现CPE，表现为细胞呈圆形或椭圆形，细胞壁增厚，折光性增强，但仍可贴壁。Reed-Muench法计算RSV的TCID50为10-8/0.1ml。本实验病毒攻击浓度为100TCID50。

2.3甘草对RSV生物合成的影响甘草实验组CPE程度均低于病毒对照组，说明甘草对RSV在细胞内的增殖具有抑制作用。在浓度0.05～6.4 mg/ml时，随着甘草液浓度的增加，抗病毒活性增强，CPE特征逐渐减弱，细胞存活率升高，但浓度继续增大后甘草对病毒生物合成的抑制率下降(见图1)。经Probit回归法计算，甘草抑制RSV的IC50=0.273 mg/ml，比TC50值小，TI为11.76。利巴韦林IC50=0.035 8 mg/ml，TI为8.18。甘草比利巴韦林的安全性高，使用安全范围大，甘草与利巴韦林在抗RSV作用方面差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4甘草抗RSV吸附作用甘草浓度为0.4 mg/ml时Hep-2细胞CPE可达到50%，1.6 mg/ml时CPE将达到25%，说明甘草能阻断RSV与细胞的吸附，抑制病毒对细胞的破坏作用。见表1。

图1　甘草对RSV生物合成的影响

2.5甘草对RSV的直接杀伤作用甘草浓度在0.8 mg/ml以上时细胞生长良好，排列规则，衰老细胞少；而病毒对照组出现明显的CPE，75%细胞出现CPE时细胞内颗粒物增多，细胞变大，碎裂、脱落，说明甘草对RSV具有直接杀伤作用。见表1。

甘草药物浓度(mg/ml)抑制吸附直接杀伤利巴韦林 药物浓度 (mg/ml)抑制吸附直接杀伤0.052.13±1.124.55±1.090.0251.34±1.452.97±1.430.1019.21±2.6721.01±1.870.05014.27±1.0217.67±1.380.2031.38±3.3435.17±2.470.10034.09±1.5236.22±2.070.4048.87±2.5251.39±1.560.20045.32±2.7149.88±2.910.8067.45±3.7874.56±2.670.40072.32±3.5475.13±2.811.6075.41±1.0183.17±3.240.80084.22±1.0182.29±3.733.2084.44±2.7993.94±2.111.60093.01±2.4094.17±1.476.4094.08±1.4595.61±1.333.20097.00±1.2193.56±1.78

3讨论

病毒对宿主细胞的致病作用是病毒致病机制中非常重要的一个方面。病毒增殖周期(吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配、成熟、释放)的任何一个或多个环节都可能是药物作用的靶点。本实验证明甘草具有明显的抑制RSV作用，既能干扰RSV的吸附、生物合成过程，也能直接对RSV产生杀伤作用。甘草比利巴韦林毒性低、使用安全范围大，在一定浓度范围内，甘草浓度与对 RSV的抑制率呈量效关系，与利巴韦林抗RSV作用无明显差异。

甘草影响RSV吸附过程可能通过其活性成分破坏RSV表面的蛋白结构，导致RSV吸附能力降低或甘草与RSV竞争结合Hep-2细胞表面的特异性受体，干扰RSV的吸附；甘草影响RSV的生物合成可能与其抑制病毒DNA聚合酶和(或)RNA反转录酶的活性有关，也可能是甘草刺激细胞分泌生物活性物质，抑制病毒DNA的复制和转录过程；甘草也能直接杀灭病毒，可能是由于甘草含有能破坏RSV包膜等结构的有效成分或活性化合物。下一步将对甘草的有效成分进行分离提取，对各成分进行抗RSV的实验研究，进一步探索甘草抗呼吸道合胞病毒的机制。

4参考文献

1Tsukagoshi H，Ishioka T，Noda M，etal.Molecular epidemiology of respiratory viruses in virus-induced asthma〔J〕.Front Microbiol，2013；12(4)：278.

2程远，陈德辉，黄向晖，等.5岁以下儿童喘息性疾病与呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒的相关临床分析〔J〕.临床儿科杂志，2014；32(4)：339-42.

3高雪岩，王文全，魏胜利，等.甘草及其活性成分的药理活性研究进展〔J〕.中国中药杂志，2009；34(21)：2695-700.

4康金森，程路峰，杨建，等.甘草总黄酮止痒作用的实验研究〔J〕.时珍国医国药，2012；23(12)：2951-3.

〔2014-09-18修回〕

(编辑郭菁/徐杰)