高效液相色谱串联质谱鉴定甘薯叶中的主要化学组成

涂宗财 温庆辉 王 辉 张 露 傅志丰

高效液相色谱串联质谱鉴定甘薯叶中的主要化学组成

涂宗财1，2温庆辉1王 辉1张 露1傅志丰1

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室1，南昌 330047）
（江西师范大学生命科学学院2，南昌 330022）

以2种肉色型甘薯叶—橘心甘薯叶（OFL）和白心甘薯叶（CFL）为原料，旨在采用高效液相色谱－电喷雾离子源－四级杆飞行时间串联质谱（HPLC－ESI－QTOF－MS／MS）比较2种甘薯叶DHPM提取物中的主要化合组成的差异。根据化合物的前体离子、MS／MS裂解规律、紫外图谱、保留时间，并与相关数据库和参考文献对照，对2种甘薯叶提取物中的主要化合物进行鉴定。结果表明，OFL是比CFL更好的抗氧化剂资源。从OFL和CFL中共鉴定出22种化合物，包括8种有机酸、3种氨基酸、4种羟基肉桂酸衍生物、3种黄酮和4种脂肪酸。因此，HPLC－ESI－QTOF－MS／MS是快速分析复杂植物提取物中化学组成的有效方法。

甘薯叶 高效液相色谱串联质谱 多酚 电喷雾离子

甘薯是我国的主要粮食之一，其产量和种植面积均居世界之首。甘薯叶是甘薯生产的主要副产物，其中含有丰富的酚酸、黄酮、花青素、膳食纤维和蛋白质等营养成分［1］。甘薯叶中多酚含量远远高于甘薯的皮、根、肉以及其他常见食用蔬菜［2－3］。然而，除少数作为饲料和蔬菜外，大部分甘薯叶被丢弃，造成了生物活性资源的严重浪费。药理学研究表明，甘薯叶具有促进胃肠消化、抗氧化、降血糖、降血压、免疫调节、抗癌和预防糖尿病等功效［1－3］。但目前大多数文献均是报道甘薯叶中活性成分的提取及提取物的生物活性，对其活性成分的分析较少，其中Carvalho等［4］采用HPLC技术对不同甘薯叶中的6种酚酸、3种黄酮和2种儿茶素进行了定量分析，Luo等［5］采用HPLC －ESI－MS／MS技术从甘薯叶中鉴定出黄酮和酚酸共24种，Islam等［6］采用HPLC技术从甘薯叶中分析出15种花青素。

高效液相色谱质谱联用技术（HPLC－MSn）结合了液相色谱高效分离和质谱高灵敏度、高特异性的优点，对复杂样品中植物化学组成的分析具有很高的灵敏性和选择性，只需对样品进行简单的预处理，即可在短时间内对提取物中的化学图谱进行初步鉴定。目前，HPLC－MSn已成为分析天然产物中化学成分强有力的工具［7］。Abu － Reidah 等［8］采用HPLC－DAD－ESI－MS／MS技术从漆树果中初步鉴定出211种化合物；同时采用反相超高效液相色谱电喷雾离子源飞行时间质谱（UHPLC－ESI－QTOF－MS）比较了3个苼菜品种中植物化学成分的差异，并从提取物中快速鉴定出了171种化合物［9］。Liu等［10］利用HPLC － ESI－ MS／MS 技术从“Mikael”、“Mortti”和“Jaloste n：o 15”3 个黑醋粟的70%丙酮提取物中分别快速鉴定出43、35和35种酚类化合物。Huang等［11］研究表明，与常规热水浸提相比，动态高压微射流辅助提取能显著提高黄酮类化合物的得率和抗氧化活性，但提取物中的主要抗氧化成分有待研究。因此，本研究以江西栽培最广的2种肉色类型甘薯叶为原料，即橘心甘薯叶（orange－flesh sweetpotato leaves，OFL）和白心甘薯叶（cream－flesh sweetpotato leaves，CFL），采用高效液相色谱－电喷雾离子源－飞行时间串联质谱技术（HPLC－ESIQTOF－MS／MS）比较2个甘薯叶品种的DHPM提取物中的主要化学组成差异，即可探明甘薯叶DHPM提取物中的主要化学组成，又可为快速鉴定植物提取物中的化学成分提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯叶于2013年11月从南昌市郊区采集。乙腈、甲酸（色谱纯）：德国Merck公司；无水乙醇、乙酸、石油醚（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；超纯水用Millipore超纯水净化系统制备。

1.2 仪器与设备

1290 HPLC／6538 QTOF － MS／MS、色谱柱：ZORBAX XDB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）：美国Agilent公司；TDL－5－A离心机：上海安亭科学仪器厂；GYB60－6S均质机：上海东华高压均质机厂；UV－Vis分光光度计：上海普析通用；M－110EH微射流：美国Microfludics公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

参照Huang等［11］的方法提取甘薯叶多酚，准确称取5.0 g甘薯叶粉末于200 mL 70%乙醇中混匀，35 MPa均质处理2次后，DHPM 100 MPa处理2次，然后45 ℃浸提2.0 h，4 000 r／min 离心15 min，最后收集上清液，并浓缩定容至100 mL。样品过0.22μm微孔有机滤膜后，HPLC－QTOF－MS／MS上样分析。

1.3.2 色谱条件

采用Agilent Technologies 1290 HPLC infinity system进行分析；色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18柱（250

mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）；洗脱条件：0 ～5 min，10%～35%B；5～20 min，35%～80%B；20 ～23 min，80%～100%B；流速：0.8 mL／min；进样量：10 μL；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；扫描波长：200～400 nm。

1.3.3 质谱条件

采用Agilent Technologies 6538 OHD Accurate－Mass Q－TOF分析；电离方式：电喷雾离子源（electronspray ionization，ESI）；喷雾电压：4 000 kV；雾化气体：N2；雾化压力：50 psi；雾化气流速：10 L／min；碰撞气体：He；碰撞电压：250V；干燥温度：350 ℃；扫描方式：负离子；离子范围：m／z 100 ～1 000；采用MassHunter工作站对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC－ESI－QTOF－MS／MS分析

OFL和CFL提取物的基峰色谱图（Base peak chromatography，BPC）如图1所示，甘薯叶中主要成分的质谱数据及化合物的相应峰面积如表1所示，通过分析每个峰的保留时间、紫外特征吸收λmax、母离子、裂解规律、分子量和分子式等信息，并与可利用的相关文献和数据库（Metlin和Massbank）对照，共鉴定或初步鉴定出22种化合物，包括8种有机酸、

3种氨基酸、4种羟基肉桂酸、3种黄酮和4种脂肪酸。由于BPC图的峰越高、峰面积越大，表明对应化合物的含量越高，而OFL中化合物的响应值比CFL高，因此OFL中的活性成分含量比CFL高，结合表1可知OFL是更好的抗氧化剂资源。

图1 OFL和CFL提取物的基峰色谱图

2.2 有机酸

化合物1、2、3和9的母离子［M －H］－分别为m／z191.067 2 （C7H11O6）、133.023 9 （C4H5O5）、191.030 8 （C6H7O7）和175.062 4（C7H11O5）。它们对应的MS／MS特征碎片离子分别为m／z 127.042 9［M－HCOOH－H2O －H］－、115.006 4［M －H2O －H］－、111.011 2［M －CO2－2H2O －H］－和115.042 2［M －CH3COOH －H］－。根据Abu－Reidah 等［9］和Cádiz－Gurrea等［12］的报道，化合物1、2、3 和9 分别鉴定为奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、异丙基苹果酸。化合物4的母离子［M－H］－为m／z 117.020 2（C4H5O4），MS／MS碎片99.009 3 和73.031 6 分别为母离子失去一个H2O和一个CO2所得，因此鉴定为琥珀酸，这与Abu－Reidah等［9］报道的琥珀酸裂解规律一致。

化合物10的前体离子［M－H］－为m／z 305.072 7（C11H13O10），MS／MS 特征离子为173.051 4 ［乌头酸－H］－和130.970 5［戊糖－H］－，证明分子中存在乌头酸和戊糖，由此推断化合物10为乌头酸戊糖苷。化合物11（［M －H］－，137.025 4）的主要MS／MS 碎片离子m／z119.016 1、109.033 8、93.038 2 分别为母离子失去一个H2O、CO和CO2所产生，证明化学中存在羟基和羧基，因此鉴定为对羟基苯甲酸，这与Regos等［13］的报道一致。由于化合物16和壬二酸有相同的母离子［M－H］－187.107 9和MS／MS特征碎片离子169.092 4［M－H2O－H］－，125.100 4［M－H2O－CO2－H］－，97.069 9［M －H2O －CO2－CO －H］－，因此鉴定为壬二酸［14］。

表1 橘心甘薯叶和白心甘薯叶提取物HLPC－ESI－QTOF－MS2分析生物活性特征

2.3 氨基酸类化合物

化合物5的母离子［M－H］－为m／z 164.072 7，碎片离子m／z 147.049 0和103.057 3为母离子接连失去NH3和CO2部分所产生，78.037 4对应于化合物的苯环部分；化合物7的母离子［M－H］－为m／z 203.084 1，碎片离子m／z 186.062 4、159.099 1、142.07、116.054 2 分别是母离子失去NH3、CO2、NH3＋CO2和CH2CH（NH2）COOH 部分产生，因此，化合物5鉴定为苯丙氨酸，化合物7鉴定为色氨酸［9］。

化合物22的母离子［M－H］－为m／z421.2030，主要的MS／MS 特征离子m／z 259.128 7、241.111 0、218.072 2、130.082 6、128.030 9 对应的碎片分别为［M －162－H］－，［M －162－H2O －H］－，［亮／异亮氨酸－H］－和［葡萄糖－H2O－H］－，根据参考文献［9］，化合物22初步鉴定为谷氨酸－亮氨酸／异亮氨酸－葡萄糖。

2.4 羟基肉桂酸类化合物

化合物6和8具有相同的母离子［M－H］－m／z 353.10（C16H18O9），其紫外最大特征吸收为226和326 nm，且在298 nm有1个肩峰，从而判定为咖啡酰奎宁酸（Caffeoylquinic acid，CQA）同分异构体。碎片离子m／z 191.07、173.05、179.04 和161.03 分别与［奎宁酸－H］－、［奎宁酸－H2O －H］－、［咖啡酸－H］－、［咖啡酸－H2O－H］－相对应。由于化合物6和8的基峰分别为179.042 3和191.062 6（MS／MS图如图2a和图2b所示），根据Lin等［15］的研究，化合物6和8分别鉴定为3－CQA和5－CQA。

图2 3－咖啡酰奎宁酸和5－咖啡酰奎宁酸的MS／MS图谱和结构式

化合物14和15的母离子［M－H］－均为m／z 515.138，其MS／MS特征离子m／z353.09 ［咖啡酰奎宁酸－H］－、191.06、179.03、173.05 表明它们为二咖啡酰奎宁酸类化合物（Dicaffeoylquinic acids，DiCQAs），通过与标准品的比对，化合物14和15分别鉴定为3，4 － diCQA 和3，5 － diCQA。Islam 等［16］在甘薯叶中曾鉴定出此类化合物。

2.5 黄酮类化合物

化合物12的母离子［M－H］－为m／z 449.211 7（C21H21O11）。MS／MS 碎片离子m／z 269.147 3、225.157 0和209.123 6对应的片段分别为［MC6H10O5－H2O－H］－、［M －C6H10O5－CO2－H］－和［M－C6H10O5－C3H8O－H］－，因此化合物12鉴定为二氢山奈酚葡萄糖苷［13］。化合物13的母离子［M－H］－为m／z 463.105 0，其MS／MS 碎片离子m／z 301.043 3、271.031 5、179.002 7、163.011 4 对应的片段分别为［槲皮苷－H］－、［槲皮苷－CH2OH］－、［葡萄糖－H］－、［葡萄糖－H2O －H］－，因此该化合物被鉴定为异槲皮苷［13］。化合物18的母离子［M－H］－和苷元离子分别为m／z 409.027 1（C17H14SO10）和329.071 9（C17H14O7），表明苷元离子是由母离子失去一个SO3所产生。碎片离子m／z 314.046 1、299.023 9、271.024 1、269.046 9 分别是苷元失去CH3、2CH3、2CH3＋ H2O、2CH3＋ CH2O 部分所产生的，通过与Metlin中的数据比对，初步鉴定苷元离子m／z329.071 9（C17H14O7）为商陆黄素或者麦黄酮，因此化合物18初步鉴定为硫酸化商陆黄素或者硫酸化麦黄酮。

2.6 脂肪酸

化合物17的母离子［M－H］－为m／z 327.220 3，碎片离子m／z309.207 5、291.201 8分别为母离子失去1个和2个水分子所产生，m／z 229.141 5、211.136 6依次是C12－C13键裂解和碎片再脱去1个水分子所产生，因此，化合物17鉴定为9，12，13－三羟基十八碳二烯酸［17］，其裂解规律如图3a所示。化合物20和21的母离子［M －H］－均为m／z 293.212 2（C18H30O3），MS／MS离子m／z275.2054和235.1714分别为母离子失去1个H2O和C14－C15键断裂形成。化合物20的碎片离子m／z 121.103 5来源于C10－C11键的断裂和脱甲酸（HCOOH）作用。化合物21的碎片离子m／z195.138 9来源于C11－C12键断裂。根据化合物17的裂解规律，化合物20和21分别鉴定为13－羟基－6，9，11－十八碳三烯酸和13－酮－9，11－十八碳二烯酸。同理，化合物24（［M －H］－，559.331 2）初步鉴定为十八碳三烯酸衍生物，主要的MS／MS离子277.217 7对应化合物十八碳三烯酸（C18H30O2）。

图3 脂肪酸的裂解途径和MS／MS图谱

3 结论

采用HPLC－QTOF－MS／MS技术比较了OFL和CFL中的主要化学成分。OFL和CFL的植物化学组成相差不大，但化合物的组成比例相差很大，OFL的BPC图响应高度及化合物峰面积明显高于CFL，以上证明OFL中多酚类化合物的含量明显高于CFL，是优于CFL的膳食多酚资源。通过对主要色谱峰的MS、MS／MS图谱和紫外光谱进行分析，初步鉴定出22种化合物。2种甘薯叶的主要化合物均为奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、苯丙氨酸、5－CQA、乌头酸戊糖苷、对羟基苯甲酸、异槲皮苷、3，4－diCQA、3，5－diCQA、9，12，13－三羟基十八碳二烯酸、硫酸化商陆素／麦黄酮、13－羟基－6，9，11－十八碳三烯酸。琥珀酸、二氢山奈酚葡萄糖苷和13－酮－9，11－十八碳二烯酸只在OFL中检测到，而谷氨酸－亮氨酸／异亮氨酸－葡萄糖和十八碳三烯酸只在CFL中检测到。其中苹果酸、异丙基苹果酸、乌头酸戊糖苷、对羟基苯甲酸、二氢山奈酚葡萄糖苷、壬二酸和脂肪酸类化合物都是第1次被在甘薯叶中鉴定。因此，在缺乏标准品的条件下，HPLC－QTOFMS／MS技术是分析天然产物复杂体系中活性成分组成的有效工具，同时本研究可为HPLC－MS／MS技术在植物组学中的应用提供参考。

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Identification of Major Chemical Constituents in Sweetpotato Leaves by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Tu Zongcai1，2Wen Qinghui1Wang Hui1Zhang Lu1Fu Zhifeng1
（State key laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University1，Nanchang 330047）
（College of Life Science，Jiangxi Normal University2，Nanchang 330022）

Taking two flesh color─orange－flesh and cream －flesh sweetpotato leaves（OFL and CFL）as materials，this study aimed to compare the chemical constituents in DHPM extractions from OFL and CFL by using high performance liquid chromatography diode array detection and quadrupole time of flight electrospray ionization tandem mass spectrometry （HPLC －ESI－QTOF －MS／MS）.The major chemical compounds of extractions from the two leaves were identified by comparing the precursor ion，MS／MSfragmentation pattern，ultraviolet spectra and retention time with relevant databases and references.The results showed that OFL is a better antioxidants resource than CFL.Totally，22 compounds were proposed in OFL and CFL extracts，including 8 organic acids，3 amino acids，4 hydroxycinnamic acid derivates，3 flavonoids and 4 fatty acids.Thus，HPLC －ESI－QTOF －MS／MScan be a useful，powerful and rapid tool in quickly analyzing the chemical constituents in complex plant extracts.

sweetpotato leaves，HPLC － MS／MS，polyphenols，ESI

S531

A

1003－0174（2016）07－0142－06

国家自然科学基金（21276118），江西省重大科技创新研究（20124ACB00600）

2014－11－28

涂宗财，男，1965年出生，教授，博士生导师，食物资源开发与高效利用