DATS调节乳腺癌干细胞P-gp及NF-κB的表达逆转ADM耐药性的研究

周 茜，王伏生（山西医科大学第二附属医院血管乳腺外科，山西 太原 030000）



DATS调节乳腺癌干细胞P-gp及NF-κB的表达逆转ADM耐药性的研究

周 茜，王伏生
（山西医科大学第二附属医院血管乳腺外科，山西 太原 030000）

【摘要】目的 研究DATS（大蒜素）逆转多药耐药的分子机制，是否通过抑制NF-κB的异常激活，降低P-gp表达，从而逆转乳腺癌干细胞多药耐药。方法 体外贴壁培养及球囊培养、流式细胞术检测MCF-7 及MCF-7/ADM两种细胞中乳腺癌干细胞的含量；球囊培养富集MCF-7/ADM中乳腺癌干细胞；MTT法检测DATS对MCF-7/ADM球囊细胞（乳腺癌干细胞）及贴壁细胞（乳腺癌细胞）毒性，流式细胞术检测DATS逆转耐药前后的ADM（阿霉素）对细胞毒性作用；Western blotting检测DATS对P-gp以及NF-κB表达的调节。结果 MCF-7细胞的球囊生成率低于耐药株，流式细胞术检测耐药株中CD44+CD24-细胞远高于非耐药株。DATS作用贴壁与球囊细胞经ADM作用24 h后凋亡增加；DATS作用下细胞P-gp与NF-κB表达下降。结论 DATS通过抑制NF-κB的异常激活，降低P-gp表达，从而逆转乳腺癌干细胞多药耐药。

【关键词】乳腺癌干细胞；MDR；DATS；P-gp；NF-κB

乳腺癌是目前女性最高发的恶性肿瘤之一。经手术放化疗后，癌症仍转移，多是由于肿瘤干细胞的多药耐药性。耐药肿瘤细胞中NF-κB的表达异常可能提示耐药性与NF-κB（nuclear factor κB，细胞核因子κB）之间存在某种联系[1]。P-gp可能是NF-κB下游基因之一，由于NF-κB激活转录，过度表达P-gp蛋白从而引起肿瘤细胞耐药[2]。DATS(diallyl trisulfide，二烯丙基三硫化物，又称大蒜素），作用靶点多且高效低毒，在逆转耐药方面有良好前景[3]。本课题研究DATS逆转乳腺癌肿瘤干细胞耐药的作用，以及是否通过抑制NF-κB的异常激活，降低P-gp的表达，由此逆转乳腺癌干细胞的多药耐药性。

1　资料与方法

1.1 一般资料

MCF-7细胞及MCF-7/ADM细胞、PE-兔抗人CD24单克隆抗体，FITC-鼠抗人CD44单克隆抗体购于嘉美生物公司，1640培养基、PBS、FBS、DMOS，MTT为Amresco公司产品。DATS购自山东鲁抗辰欣药业、AnnexinV-FITC/PI细胞调亡流式检测试剂盒、碘化丙啶购自Mbchem公司。阿霉素（ADM）购自山西医科大学二附院。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7及MCF-7/ADM贴壁与球囊细胞培养。0.25%胰酶消化对数生长期细胞，25 cm2培养瓶添加培养基10 mL，调节细胞浓度至1×103/mL。置于恒温培养箱中，24 h轻晃1次，每3天采用半量换液法换液，第10日计数球囊形成率。

1.2.2 流式细胞仪检测MCF-7及MCF-7/ADM细胞株中细胞比例。加入FITC抗体及PE抗体各

2 μL于500 μL细胞悬液中，以2×105/L的细胞浓度重悬，取

1.2.3 采用MTT法增殖抑制法选取DATS浓度。DATS设置 5个浓度组（10、20、40、60、80 μmol/L），测定作用24 hDATS对MCF-7/ADM球囊细胞（乳腺癌干细胞）及贴壁细胞（癌细胞）的毒性。

1.2.4 流式细胞术检测MCF-7/ADM球囊细胞及贴壁细胞的凋亡。加入5 μmol/L的ADM和10 μmol/L的DATS，两组细胞在37℃，5%Co2、饱和湿度下培养24 h。加5 μL Annexin V/FITC和10y 1（20 μg/mL）的PI溶液，用流式细胞仪检测细胞凋亡软件分析数据。

1.2.5 Western blotting检测MCF-7/ADM球囊细胞的P-gp表达变化。10%SDS-PAGE分离蛋白、转膜、5%BSA封闭，鼠抗人P-gp一抗孵育过夜，酶标二抗室温孵育60min，曝光。

1.2.6 NF-κB活性使用凝胶迁移电泳率实验（Eiectrop1oretic Moiety Slift Assay，EMSA）方法检测：1×1011/L细胞加入核蛋白提取液A 500 μL冰上充分裂解、离心，取沉淀加入核蛋白提取液，冰浴、离心，取上清为核蛋白，Bradford法检测蛋白浓度。采用T4多核苷酸激酶末端将NF-κB探针标记上［γ-32P］ATP。将提取的核蛋白与同位素标记的探针在缓冲液中充分结合，行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。以积分吸光度值作为NF-κB活性的量化值。

1.2.7 不同浓度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）的PDTC（NF-κB抑制剂）处理，继续培养24 h。提取总蛋白，进行Western印迹分析P-gp表达。不同时间（0 h、12 h、24 h、48 h）的PDTC处理，加入20 μmol/L的PDTC，提取总蛋白，进行Western blotting分析P-gp表达。

1.3 统计学分析

对于符合正态分布资料，两组数据之间采用t检验。对于不符合正态分布或者方差不齐的采用x2检验。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

1）MCF-7细胞以及MCF-7/ADM细胞在培养3日后形成球囊，第10日时球囊生成率分别为（1.039±0.57%）与（10.25±0.47%），两种细胞株中细胞的比例分别为（2.83±1.38%）和（63.93±2.31%）。MCF-7/ADM细胞株中乳腺癌干细胞含量更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（图1、表1）

2）给予MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞不同浓度DATS，通过MTT法检测DATS的细胞毒性。在不同浓度的DATS处理24 h后，10、20、40 μmol/L时MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞生存率差异无统计学意义（P＞0.05），当DATS浓度为60、80 μmol/L时，MCF-7/ADM球囊细胞存活率明显高于贴壁细胞且差异具有统计学意义（P＜0.05）。DATS浓度在60 μmol/L时，两组细胞凋亡率明显。（图2）MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞予以相同的化疗压力，DATS干预前后化疗药物的细胞毒作用。结果显示加入5 μmol/L ADM 24 h后，细胞凋亡率低于联合10 μmol/DATS细胞组（25.46±0.58，41.07±0.29）%；同样，单纯加入ADM的球囊细胞的细胞凋亡水平低于联合DATS细胞组（5.42±0.31，10.30±0.79）%，以上差异有统计学意义（P＜0.05）。只加入ADM的贴壁细胞与球囊细胞经24 h撤药修复后，凋亡率分别下降（20.86±0.50，3.89±0.41）%与24 h前两组细胞相比差异无统计学意义（P ＞0.05）。在DATS存在情况下撤除化疗药24 h后，贴壁细胞与球囊细胞凋亡率均上升（45.11±0.67 vs 11.53±2.2）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　MCF-7（左）与MCF-7/ADM（右）球囊细胞形成

表1　流式细胞术检测球囊细胞形成率

图2　不同浓度DATS对MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞24 h后凋亡率

3）MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞P-gp吸光率在无药物干预下分别为（0.86±0.12，0.93±0.05）；两组细胞再加入10 μmol/LDATS后P-gp表达减弱（0.82±0.23，0.86±0.33）%，说明DATS对P-gp有抑制作用，在联合ADM后，抑制作用更明显（0.65±0.14，0.72±0.90）。

4）无药物作用时，MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞NF-κB高表达（0.82±0.05，0.89±0.15）%，10 μmol/LDATS加入后抑制NF-κB活性（0.79±0.13，0.83±0.23）%，联合ADM后，表达减弱明显，吸光度下降（0.62±0.09，0.67±0.03）%。

5）不同浓度、时间PDTC处理后再次使用化疗药物，对P-gp表达的影响，结果表明，不同浓度PDTC（0、20、40、60、80 μmol/L）处理时，MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞在10 μmol/L DATS联合5 μmol/LADM和0 μmol/L PDTC比联合80 μmol／L的PDTC处理24 h后对P-gp的表达有明显的抑制作用；20 μmol/L的PDTC与DATS和ADM一同处理0 h、12 h、24 h、48 h后P-gp的抑制表达变化不明显。

3　讨 论

实验发现DATS在低浓度对细胞无杀伤作用情况下，能够使化疗药物对已耐药的细胞重新作用。那么DATS逆转ADM耐药机制是否通过抑制P-gp的表达实现的?MCF-7/ ADM细胞膜上P-g有明显表达，加用DATS后有明显的抑制作用。证明DATS可以通过抑制乳腺癌干细胞上P-gp蛋白表达而逆转耐药。NF-κB可以提高肿瘤细胞多药耐药基因的表达，使肿瘤细胞内化疗药物浓度下降而产生抗药性[5]。也有研究证明，乳腺癌细胞MCF-7细胞中NF -κB可调控人MDR1启动子活性[6]。实验发现MCF-7/ADM细胞中NF-κB高表达，但在使用DATS后表达减弱，联合NF-κB抑制剂后，P-gp抑制不明显。那么，可以考虑DATS的逆转耐药途径是通过NF-κB从而抑制P-gp，使化疗药物再次起作用。

参考文献

[1] Gottesman MM,Fojo T,Bates SE,Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat Rev Cancer,2002,2:48-58.

[2] CHOIB H, KIMC G,LIM Y,et al. Curcumin down - regulates the multidrug -resistancemdrlb gene by inhibiting the PI3K/Akt/NFKB pathway[J].Cancer Lett,2008,25(1):111 -118

[3] Yu FL,Bender W,Fang Q,et al.Prevention of chemical carcinogen DNA binding and inhibition of nuclear RNA polymerase activity by organosulfur compounds as the possible mechansisms for their anticancer initiation and proliferation effects[J].Cancer Deterct Prev,2003,27(5):370-372.

[4] 张 燕,沈 宜.大蒜素抗肿瘤作用及其机制研究进展[J].国外医学·肿瘤学分册,2005,32(7):527-529.

[5] Lin YG, Kunnumakkara AB,Nair A,et al.Curcumin inhibits tumor growth and angiogenesis in ovarian carcinoma by targeting the nuclear factor-kappa B pathway [J].Cline Cancer Res,2007,13(11):3423-3430.

[6] OGRETMEN B, SAFA A R. Negative regulation of MDR1 promoter activity in MCF-7,but not in multidrug resistant MCF-7/ADR, cells by Cross-coup led NF-kappa B/p65 and c-Fostranscription factors and their interaction with the CAAT region[J].Biochemistry,1999,38(7):2189-2199.

【文献标识码】A

【中图分类号】R737.9