补阳还五汤和星蒌承气汤对脑缺血大鼠神经元突触重塑及胶质源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响

补阳还五汤和星蒌承气汤对脑缺血大鼠神经元突触重塑及胶质源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响

刘会贤刘敬霞俞维黑长春1李娟刘洋李晶晶

(宁夏医科大学附属回医中医医院，宁夏吴忠750004)

摘要〔〕目的观察补阳还五汤和星蒌承气汤对脑缺血大鼠神经元突触重塑的作用及其对胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)和神经生长相关蛋白-43(GAP-43)、突触后致密物-95(PSD-95)表达变化的影响。方法120只大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、星蒌承气汤和补阳还五汤组；线栓法制备大脑中动脉阻塞模型；灌胃用药并分别于14 d、28 d取材；电子透射电镜观察神经元突触变化，免疫组织化学法检测GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表达变化。结果与假手术组比较，14 d模型组GDNF表达明显减弱(P<0.01)，28 d模型组GAP-43表达明显减弱；与模型组比较，补阳还五汤14 d和28 d组 GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF表达均明显增强(P均<0.05)，14 d星蒌承气汤组NGF表达显著增强(P<0.01)，28 d星蒌承气汤组GDNF表达显著增强(P<0.01)；与尼莫地平比较，14 d补阳还五汤组 PSD-95、NGF、GDNF表达均明显增强(P均<0.05)，28 d补阳还五汤组PSD-95表达显著增强(P<0.05)；与14 d比较，28 d补阳还五汤组PSD-95表达显著增强(P<0.01)。结论补阳还五汤可明显促进缺血后神经元突触重塑，其机制可能是通过上调缺血脑组织中NGF、GDNF的表达从而使GAP-43、PSD-95表达增加而实现。星蒌承气汤可以上调缺血脑组织早期NGF表达而其远期作用不明显。

关键词〔〕脑缺血；补阳还五汤；星蒌承气汤；神经生长因子；胶质源性神经营养因子；神经生长相关性蛋白-43；突触后致密物-95

中图分类号〔〕R285.5〔

基金项目：宁夏医科大学特殊人才项目(XT200911)

通讯作者：刘敬霞(1970-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中医药防治老年病研究。

1宁夏医科大学基础医学院

第一作者：刘会贤(1987-)，女，住院医师，硕士，主要从事中医药防治老年病研究。

脑缺血后的大脑功能可塑性机理研究一直是脑科学研究的热点，研究表明，神经元突触对缺血性损伤极为敏感，缺血性脑损伤会导致神经元突触数目、功能、结构的变化，这种变化直接影响到神经信息的传递〔1，2〕。神经生长因子(NGF)是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，可以上调神经生长相关蛋白43(GAP-43)表达，促进突触重建，对神经元起保护作用〔3～5〕。近年研究发现中医药可以通过各种机制促进缺血后神经元突触重塑从而发挥脑保护作用〔6，7〕。本研究探讨补阳还五汤和星蒌承气汤对脑缺血神经元突触重塑的作用及机制。

1材料与试剂

1.1动物SD大鼠，普通级，120只，3～4月龄，体重(300±50)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(宁)2011-0001。饲养于宁夏医科大学实验动物中心动物饲养室，以标准固型普通饲料分组喂养，每组12只。动物饲养室温度(26±1)℃，相对湿度50%。

1.2试剂和仪器6.5%水合氯醛(宁夏医科大学附属医院制剂中心提供，批号H20080018)。NGF(PR-0305)、胶质源性神经营养因子(GDNF，SC-328)、GAP-43(PM-0275)、突触后致密物(PSD)-95(PR-0286)、DAB显色剂等，以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3药物

1.3.1补阳还五汤方生黄芪120 g、归尾6 g、地龙6 g、川芎3 g、桃仁3 g、红花3 g，生药总量141 g；由宁夏医科大学中医门诊部药剂科提供，方中所用生药材去除杂质，按组方剂量配比，加入生药材10倍量水，浸泡60 min后用TC-15套式恒温器250 V电压加热煎煮；沸腾后将电压调低至150 V，保持微沸状态煎煮30 min，滤取煎液；药渣再加入生药材8倍量的水，浸泡30 min后煎煮，保持微沸状态煎煮30 min，滤取煎液；合并两次煎液，将药液于恒温水浴锅(100 ℃)蒸发水分至浓稠状，浓缩至药液含生药2.6 g/ml，4 ℃保存备用；临用前加蒸馏水稀释至生药材含量为1.3 g/ml。

1.3.2星蒌承气汤方全瓜蒌30 g、胆南星6 g、生大黄9 g、芒硝9 g，生药总量54 g。由宁夏医科大学中医门诊部药剂科提供，具体煎药方法同补阳还五汤，其中大黄后下，芒硝冲溶。将药物浓缩至1.0 g/ml，方法同上，4 ℃保存备用；临用前加蒸馏水稀释至生药材含量为0.5 g/ml。

1.3.3尼莫地平片拜耳医药保健有限公司提供，30 mg/片，批号：H20003010。

1.4方法

1.4.1分组与给药SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、尼莫地平组、星蒌承气汤组、补阳还五汤组；后四组根据术后分批取材的时间点又各分为14 d、28 d组；每组12只。所有动物于动物清醒后按相应分组开始灌胃给药，给药剂量按动物与人体表面积折算：补阳还五汤13.0 g·kg-1·d-1；星蒌承气汤5.0 g·kg-1·d-1；尼莫地平10.8 mg·kg-1·d-1。每周称重1次大鼠体重，按体重变化加减用量，模型组和假手术组以蒸馏水代替，连续灌胃14 d。

1.4.2动物模型的制备参照改良的Longa法制备局灶性脑缺血动物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，颈前正中切口，左侧钝性分离颈总动脉；分离颈内外动脉，穿线备用；于颈外动脉近动脉分叉处剪口，栓线穿入颈内动脉，缓慢推进，直至感觉有阻力为止，穿线成功后缝合皮肤。假手术组除不穿入栓线外，其余操作相同。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃，保持室温(26±1)℃。

1.4.3 取材造模当天开始灌胃，术后连续灌胃14 d，分别于14、28 d进行神经功能评分；麻醉大鼠，4%的多聚甲醛溶液灌注固定后断头取脑，于冰盘上迅速分离大脑半球，取左侧半球，自额极向后至枕极剔除脑组织3 mm，向后冠状切取脑组织1 mm，旁开3 mm切取3块1 mm×1 mm×1 mm标本用4%戊二醛溶液固定，待做电镜检测；再依次向后冠状切取2 mm厚的脑组织用4%多聚甲醛溶液固定，待做脑组织病理检测和免疫组化指标测定。

1.4.4指标检测

1.4.4.1电镜标本制作将所取脑组织切成1 mm3的小块，浸入2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.2)固定48 h。1%四氧化饿后固定1 h。丙酮逐级脱水，包埋。LKB-5超薄切片机切片，厚度为50 nm。醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。透射式电子显微镜H-600照相，加速电压80 kV。

1.4.4.2免疫组化步骤切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢室温避光灭活10 min，去离子水冲洗一遍，切片置于枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波热修复10 min，自然冷却至室温；5%山羊血清室温封闭20 min，滤纸吸干，滴加一抗，4 ℃孵育过夜，室温放置10～15 min；滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鲜配制的DAB显色剂，显微镜下控制显色时间，自来水终止显色。以上各步骤间均以0.01 mol/L PBS(pH7.4)清洗5 min×3。最后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗，余相同。GAP-43、PSD-95、NGF、GDNF均按照以上步骤进行。

1.4.4.3阳性表达观察及测定每组取6张免疫组化切片，每张切片选取5个视野，利用奥林帕斯 DP Ctroller 3.1.1.267 图像采集系统拍照，固定相机光源亮度。采用Image Pro Plus 6.0图像全自动分析系统分析反映NGF、GDNF、GAP-43及PSD-95的表达。

1.5统计学处理采用SPSS18.0软件进行多因素方差分析、最小显著差法(LSD-t)、秩转换的非参数检验。

2结果

2.1电镜下神经元突触变化假手术组细胞器形态结构未见异常；模型14 d组大鼠脑组织超微结构破坏明显。模型28 d组大鼠神经细胞超微结构改变较14 d模型组改善，细胞质明显水肿，细胞器数量显著减少；线粒体水肿，嵴的数量减少，排列紊乱，部分嵴和膜融合，线粒体有致密化现象，部分核膜融合，粗面内质网脱颗粒，游离核糖体数量明显减少。尼莫地平14 d组神经元周围轻度水肿，细胞器数量减少；神经元线粒体部分嵴和膜融合，粗面内质网脱颗粒现象，游离核糖体数量减少。尼莫地平28 d组神经元超微结构改变较14 d组改善，线粒体有空化，出现次级溶酶体。星蒌承气汤14 d组和28 d组神经元超微结构较模型组改善，其中28 d组有脂滴和次级溶酶体出现。补阳还五汤14 d组线粒体轻度病变，突触小泡聚集成堆，突触内线粒体轻度改变；补阳还五汤28 d组线粒体改变轻微，细胞核膜稍有不整形，突触内突触小泡和线粒体的改变轻微。

2.2大鼠脑组织GAP-43变化假手术组可见棕黄色GAP-43阳性表达，与模型组比较，14 d和28 d补阳还五汤组GAP-43表达明显增强(P<0.01，P<0.05)；与星蒌承气汤组比较，14 d和28 d补阳还五汤组GAP-43表达明显增强(P<0.05)；各组28 d GAP-43表达均较14 d组明显减弱，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠脑组织GAP-43、PSD-95、NGF及GDNF表达水平比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与尼莫地平组比较：5)P<0.05，6)P<0.01;与星蒌承气汤组比较：7)P<0.05，8)P<0.01；与14 d组比较：9)P<0.05，10)P<0.01

2.3大鼠脑组织PSD-95变化假手术组可见棕黄色PSD-95阳性表达。与模型组及各药物组比较，14 d和28 d补阳还五汤组PSD-95表达均明显增强(P<0.05)，且补阳还五汤28 d组PSD-95表达较14 d组显著增强(P<0.01)。见表1。

2.4大鼠脑组织NGF变化假手术组大鼠NGF呈棕褐色弱阳性表达。与模型组比较，14 d补阳还五汤组、星蒌承气汤组NGF表达均显著增强(P<0.01)，28 d尼莫地平组和28 d补阳还五汤组NGF表达显著增强(P<0.01)；与尼莫地平组比较，14 d补阳还五汤组NGF表达显著增强(P<0.01)；与星蒌承气汤组比较，14 d补阳还五汤组NGF表达有升高趋势，但未显示统计学意义(P>0.05)；与14 d组比较，28 d模型组及尼莫地平组NGF表达均明显减弱(P<0.05)，28 d补阳还五汤和星蒌承气汤组显著减弱(P<0.01)。

2.5大鼠脑组织GDNF变化假手术组GDNF呈棕黄色，出现弱阳性表达。与模型组比较，14 d和28 d尼莫地平组GDNF表达明显增强(P<0.05)，14 d和28 d补阳还五汤组及28 d星蒌承气汤组GDNF表达均显著增强(P<0.01)；与尼莫地平及星蒌承气汤组比较，14 d补阳还五汤组GDNF表达显著增强(P<0.01)；与14 d组比较，模型组、尼莫地平及补阳还五汤组GDNF表达均显著降低(P<0.01)。

3讨论

突触结构是大脑神经元间进行神经信息传递的物质结构基础，作为神经系统的重要结构单位，突触的数量及其结构完整性对维持大脑功能的正常发挥起到了至关重要的作用。95PSD-95是突触后致密物质中的一个主要蛋白，在脑组织内广泛分布，其在介导和整合突触信号传递过程起到了重要作用〔8〕。研究表明它直接参与了缺血信号的转导，对突触功能和神经元的存活具有明显影响，PSD的改变直接影响突触的传递功效〔9～11〕。GAP-43是近年来分离鉴定的一种钙调蛋白结合胞膜磷酸蛋白，在神经元的发育和再生过程中，GAP-43伴随着轴突的生长大量合成，是轴突生长的一种标记物〔12〕。研究发现，脑缺血后神经元突触重塑相关蛋白的表达随缺血时间的变化而变化，其表达与缺血损伤的程度密切相关〔13〕。脑梗死后脑内GAP-43表达在缺血再灌注1 w时即达到高峰，2 w后开始下降且中动脉栓塞后3～14 d缺血半暗带区GAP-43含量升高与患肢功能恢复同步进行〔14，15〕。已有的研究发现补阳还五汤可以通过促进GAP-43和突触素-1(Synapsins-1)蛋白表达而促进缺血后神经元突触重塑〔16〕。本研究认为，具有益气活血通络作用的补阳还五汤促进脑缺血损伤后神经元突触重塑的作用更为显著和持久。

NGF是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子。脑损伤时脑内源性NGF在皮层和海马区域的表达增加，对神经元起保护作用〔17，18〕。GDNF是由Lin等〔19〕于1993年从大鼠胶质细胞系B49分离纯化出的一种具有神经营养作用糖基化二硫键结合的同二聚体蛋白质。体外培养和动物体内实验研究发现，GDNF对中枢和外周运动神经元、感觉神经元及交感神经元等多种神经元也具有同等营养作用，在促进神经元存活、生长、分化、神经再生、轴突形成及轴突的可塑性等方面具有其他神经生长因子不可替代的作用。近年来的研究发现，脑缺血后神经营养因子表达的增加对神经元突触重塑起促进作用〔20，21〕，而中医中药促进缺血损伤后神经营养因子的表达已有大量研究〔22，23〕。本研究认为，早期应用补阳还五汤对远期神经元突触重塑有促进作用，其发挥作用的机制可能是通过促进NGF、GDNF的表达，进而上调GAP-43、PSD-95水平而实现。星蒌承气汤可在早期上调NGF表达而其长期作用不明显，考虑与长期通腑邪热导滞耗损正气有关，中风证候多属本虚标实，因此临证需中病即止，扶正兼顾祛邪方可取效最佳。

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〔2013-06-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)