碱预处理对玉米秸秆酶解效果的影响

迟聪聪， 柳　咪， 龚亚辉， 李鸿魁， 吴养育

(1.陕西科技大学 轻工与能源学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安　710021； 2.齐鲁工业大学 制浆造纸科学与技术教育部重点实验室， 山东 济南　250353； 3.中兴通讯股份有限公司， 陕西 西安　710065)



碱预处理对玉米秸秆酶解效果的影响

迟聪聪1,2， 柳咪1， 龚亚辉3， 李鸿魁1， 吴养育1

(1.陕西科技大学 轻工与能源学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安710021； 2.齐鲁工业大学 制浆造纸科学与技术教育部重点实验室， 山东 济南250353； 3.中兴通讯股份有限公司， 陕西 西安710065)

摘要：在不同条件下对玉米秸秆进行碱预处理，研究了其对整个转化过程糖得率的影响，从而为木质纤维素预处理及酶水解的分形研究奠定了基础.研究结果表明，碱预处理提取液的固含量随碱浓的增大而上升，这可能是碱降解木质素所致，木糖得率整体呈上升趋势，不同条件预处理后底物的酶水解糖得率存在明显差异.以预处理提取液与酶水解液中总糖得率之和作为评价指标，通过正交试验设计,获得了本研究预处理条件范围内的优化结果为：温度70 ℃、碱浓15%、时间6 h.极差分析三因素对预处理提取液及酶水解液中总糖得率影响的主次顺序为：碱浓>温度>时间.方差分析结果表明，碱浓对整个转化过程总糖得率具有显著影响，而温度和时间的影响则不显著.

关键词：玉米秸秆； 碱预处理； 酶水解

0引言

近年来，随着经济全球化发展、科技进步以及人们生活水平的提高，资源短缺与能源危机日益加剧，因此人们越来越关注于寻找一种可持续利用的生物质能源，以减少人类对传统石化资源的依赖[1,2].其中，生物质转化燃料乙醇，因其可再生及少污染等特性而成为最具应用前景的可再生能源之一，已经引起了人们的广泛关注[3].

木质纤维原料转化为燃料乙醇，主要包括原料预处理、酶水解和戊糖己糖发酵等工艺[4].由于木质纤维原料结构致密复杂，纤维素结晶度高，不利于酶水解，因此酶解前必须经过预处理，以提高酶对纤维素的可及度，从而提高酶解效率[5,6].最理想的结果是预处理既可有效提高酶解效率，又能降低总转化成本.

目前，常见的预处理方法主要有物理法、化学法和生物法[7].其中，物理法预处理虽然能对生物质内部结构产生一定的破坏作用，但破坏程度较低，且需较高能耗；化学预处理技术则要求反应设备耐酸碱腐蚀，因为稀酸和稀碱在一定条件下处理生物质原料时具有处理效率高、耗时短、能耗低、能连续操作等优点；生物法利用特定的微生物对纤维素、木质素进行降解，反应条件温和，但该过程反应时间长，并且对反应环境要求严格，降解效率亦较低[8,9].

刘伟等[10]采用稀硫酸、氢氧化钠、氨水及氢氧化钙分别对玉米秸秆进行预处理，发现氢氧化钠预处理效果更佳，总还原糖得率与未预处理相比时提高了10.7倍;Jeya等[11]采用正交设计研究发现碱预处理对纤维素酶水解具有一定的促进作用;Ibrahim等[12]采用氢氧化钠预处理稻草秸秆，发现预处理后稻草秸秆的综纤维素含量增加，而木素含量降低，有利于后续酶水解.

本研究以玉米秸秆为原料，磨粉后进行氢氧化钠预处理，酶解糖化后以预处理提取液与酶解液中的总还原糖得率之和作为评价指标，获得了较好的预处理工艺条件.该研究结果对木质纤维素预处理及酶水解过程的分形研究具有指导意义.

1实验部分

1.1实验原料

玉米秸秆取自西安市马王镇，风干、去除外层叶片、切段、磨粉、筛选，取未通过40目筛的粉末作为研究对象.

1.2主要仪器及试剂

(1)主要仪器：THZ-82型数显水浴恒温振荡器，常州博远实验分析仪器厂；飞鸽牌系列KA-1000型离心机，上海安亭科学仪器厂；UV752型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-3C型PH计，上海仪电科学仪器股份有限公司.

(2)主要试剂：氢氧化钠，分析纯，天津市进丰化工有限公司；间苯三酚，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；木糖，生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司；葡萄糖，分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司；纤维素酶，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法[13]测定其酶活为0.031 FPU/g.

1.3实验方法

1.3.1碱预处理

碱预处理在恒温振荡水浴锅中进行.反应条件为：绝干玉米秸秆粉5 g，振荡转速140 rpm，固液比1∶10(g∶mL)，氢氧化钠溶液浓度1%、5%、10%、15%等，温度60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃等，预处理反应时间3 h、6 h、9 h、12 h等.

反应结束后，固液分离，玉米秸秆粉用去离子水充分洗涤至中性，风干备酶水解用，预处理提取液用于分析单糖浓度及固形物含量.其预处理条件及对应试样编号如表1所示.

表1　预处理条件

续表1

试样编号温度/℃碱浓/%时间/h5678701510156312991011128015101591236131415169015101512963171819202180101112131466666

注：反应时间均为保温时间

1.3.2酶解糖化

将章节1.3.1所得底物在恒温振荡水浴锅中进行酶水解.酶解条件为：温度50 ℃，转速180 rpm，反应时间48 h，底物浓度5%，酶用量1 g/kg底物，乙酸/乙酸钠缓冲溶液pH=4.8.酶解完成后,进行固液分离，酶解液离心后取上清液，待还原糖分析用.

1.3.3还原糖分析

参考文献酶解液及碱预处理提取液中的五碳糖及六碳糖分析，采用紫外-可见分光光度计，其具体方法可[14].酶解还原糖产率y1及预处理提取液中还原糖得率y2的计算公式如下：

(1)

(2)

1.3.4原料中总糖分析

将经过苯醇抽提过后的玉米秸秆粉试样进行两步酸水解[15].第一步先用72% H2SO4处理，常温下保温2.5 h；第二步用3%H2SO4水解并煮沸反应4 h.反应结束后进行固液分离，按照章节1.3.3所述分析滤液中五碳糖与六碳糖的含量，两者之和即为原料中总糖.

2结果与讨论

2.1预处理对提取液的影响

玉米秸秆粉在不同条件下进行碱预处理，其提取液的固形物及木糖得率结果如表2所示.由表2可知，在一定范围内，当温度及反应时间一定时，预处理提取液的固含量(不包含碱)随碱浓的增大而升高，这可能是由于在碱的作用下，木质素与碳水化合物间的连接键断裂，破坏了木质素结构进而达到去除木质素的目的[16]；此外，半纤维素也会发生一定程度的水解而溶出小分子碎片.

NaOH亦会使纤维素产生明显的润胀作用，增加内表面积及降低纤维素结晶度[17].提取液的糖类分析结果表明，其主要组分为木糖，几乎不含葡萄糖，这是因为NaOH可以有效去除玉米秸秆结构中的乙酰基，有利于半纤维素降解；另一方面，由于研究所用测糖方法主要用于分析五碳糖，再加上提取液中葡萄糖量相对较少，因而结果显示葡萄糖含量接近零.

结合表2中木糖得率随碱浓的变化趋势，虽然两者之间无明显线性关系，但当碱浓最高为15%时，木糖得率最高为30.15%.这可能是因为碱浓越高，去除木质素越多，因而增加了碱与半纤维素的接触面积而使得最大程度地向木糖转化.

表2　玉米秸秆碱提取液分析结果

注：木糖得率=预处理液中木糖/原料中总糖，下同.

2.2碱浓对提取液及酶解液中总糖得率的影响

预处理条件对提取液及酶解液中总还原糖得率的影响如图1所示.图1(b)显示，碱浓越高，则预处理提取液中总糖得率亦越高.

由图1(a)可知，酶解液中主要成分为葡萄糖且得率较低，木糖含量则较少且保持稳定状态.这是由于纤维素酶主要降解纤维素为葡萄糖，而对半纤维素几乎不起作用，并且其酶活及酶解效率较低.因此，图1(a)中所示总糖与葡萄糖的变化趋势相一致，但与木糖的变化趋势则大不相同.

由图1(a)还可发现，随着碱浓升高，酶解液中葡萄糖得率并非线性递增，而是呈现先增加后减少最后又增加的趋势，这可能是因为在预处理阶段，由于碱浓较高，预处理提取液中降解溶出的还原糖量较大(符合图1(b)中预处理还原糖的变化趋势)，导致酶水解底物中的总糖含量较低，因而酶解糖得率亦较低，但也有可能是因为测量误差所致.

(a)酶解总糖

(b)预处理提取液及酶解液总糖图1　碱浓对转化过程糖得率的影响(预处理条件为：温度70 ℃、时间6 h、转速140 rpm)

图1(b)还表明,预处理及酶水解过程所得总糖得率之和随着碱浓的升高而基本呈上升趋势.当碱浓为13%及14%时，糖得率虽有小幅下降，但波动不大，这可能是由于测量误差所致.

2.3预处理工艺优化

影响木质纤维素碱预处理效果的因素主要有时间、温度、碱浓等.本试验以此3个因素为研究对象，设计了L16(45)正交试验,并以预处理提取液与酶解液中总还原糖得率之和作为主要评价指标进行了分析比较.

2.3.1正交试验极差分析

为进一步明确各因素对总还原糖得率的响应关系，对正交试验进行极差分析,如表3所示，并作因素与水平效应曲线，如图2所示.

从极差分析结果可以看出,三因素对总还原糖得率影响的主次顺序为：碱浓>温度>时间；三因素的最优水平为：温度70 ℃、碱浓10%、时间6 h.碱浓是影响总还原糖得率的最主要因素，而在设计正交试验过程中碱浓的四水平间隔较大，因而在温度70 ℃、时间6 h的条件下进一步细化碱浓(10%、11%、12%、13%、14%、15%等)对总还原糖得率的影响，由图1(b)可知，当碱浓为15%时，其预处理提取液及酶解液中总还原糖得率之和最高，达31.14%，由此可知其最佳预处理条件为:温度70℃、碱浓15%、时间6 h.

表3　正交试验极差分析结果

从正交试验因素与水平效应曲线可以进一步看出各因素对响应值的影响，图(2)中各点代表各因素不同水平下的值.由图2(a)可以看出，温度60 ℃和70 ℃时的总还原糖得率差别不大，且温度的影响效果不显著，故从经济效益角度考虑，预处理温度可以选择60 ℃；图2(b)显示出碱浓对还原糖得率的影响较大，在不同碱浓下的总糖得率差异较大；图2(c)表明预处理时间对总糖得率的影响亦较大，但相比碱浓稍弱，这与正交试验的极差分析结果相一致.

(a)温度对总糖得率的影响

(b)碱浓对总糖得率的影响

(c)时间对总糖得率的影响图2　正交试验因素与指标效应曲线(纵坐标为预处理提取液与酶解液中总还原糖得率之和)

2.3.2正交试验方差分析

对上述正交试验进行方差分析，其结果见表4所示.

表4　正交试验的方差分析结果

从表4可以看出：总还原糖得率影响因素的主次顺序为B>A>C，即碱浓>温度>时间，得到的最优组合为A2B3C2，即温度70 ℃、碱浓10%、时间6 h.同时，对各因素影响显著性水平进行F检验，其结果显示，因素A和C对响应值的影响均不显著，因素B对响应值具有显著影响.

通过正交试验方差分析结果可以进一步看出，碱浓是影响碱预处理的主要因素，其对木质素的去除具有显著影响，从而影响了总糖得率.

3结论

(1)NaOH预处理可降解部分半纤维素及木质素.在一定范围内，当温度及反应时间一定时，随着碱浓增大，其固含量升高，木糖得率整体呈上升趋势.

(2)在不同碱浓、时间及温度的预处理条件下，预处理提取液与酶解液中总还原糖得率有明显差异.本试验条件范围内的优化结果为：碱浓15%、时间6 h、温度70 ℃.

(3)影响NaOH预处理效果的三因素对整个转化过程还原糖得率影响的主次顺序为:碱浓>温度>时间；其方差分析结果显示，碱浓对转化过程总糖得率具有显著影响，而温度和时间的影响则不显著.

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Effects of alkaline pretreatment on the enzymatic

hydrolysis efficiency of corn straw

CHI Cong-cong1,2， LIU Mi1， GONG Ya-hui3， LI Hong-kui1， WU Yang-yu1

(1.College of Light Industry and Energy, Shaanxi Province Key Laboratiory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Key Laboratory of Pulp and Paper Science & Technology of Ministry of Education, Qilu University of Technology, Jinan 250353， China; 3.Zhongxing Telecommunication Equipment Corporation, Xi′an 710065, China)

Abstract:Alkaline pretreatment was done on corn straw powder under different conditions.The impact on the total yield of reducing sugar is investigated,which will lay foundation for the fractal characterization of lignocellulose pretreatment and enzymatic hydrolysis.Results show that the solid content in the filtrate is higher for higher alkaline concentration,which maybe the cause of lignin degradation,while the variation trend of xylose yield is increased.There is remarkable difference of sugars yield throughout the total process among different pretreatment conditions.Based on the orthogonal experimental design,the optimum condition within the range of our experiments is alkali dosage 15% at 70 ℃ for 6 hours,which is evaluated by the total reducing sugar yield.Range analysis results show that the order in effects of total sugars yield is:alkali concentration>temperature>reaction time.The variance analysis indicates that alkali concentration has significant impact on the total sugars yield,while temperature and time are insignificant.

Key words:corn straw; alkaline pretreatment; enzymatic hydrolysis

中图分类号：TQ353

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2015)05-0013-06

作者简介:迟聪聪(1981-)，女，山东青岛人，讲师，博士，研究方向：木质纤维资源高效转化及应用

基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20126125120002); 陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年人才项目(2015JQ3077)； 齐鲁工业大学制浆造纸科学与技术教育部重点实验室开放基金项目(KF201401)； 陕西科技大学博士科研启动基金项目(BJ11-18)；

收稿日期:*2015-07-11