盐酸多西环素对哮喘大鼠基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1平衡的影响

王　亮，倪为波，杨红申

(1.河北省胸科医院呼吸科，河北 石家庄 050041；河北医科大学第二医院呼吸科，河北 石家庄 050000)

盐酸多西环素对哮喘大鼠基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1平衡的影响

王亮1，倪为波1，杨红申2*

(1.河北省胸科医院呼吸科，河北 石家庄 050041；河北医科大学第二医院呼吸科，河北 石家庄 050000)

[摘要]目的通过观察多西环素对哮喘大鼠基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)/基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)平衡的影响，探讨哮喘临床治疗的新途径。方法SD健康雄性大鼠33只随机分为3组，即正常对照组、哮喘模型组、多西环素干预组，每组11只。通过口腔灌服多西环素的方式对哮喘大鼠进行干预，观察大鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1的表达。结果哮喘模型组细胞总数、嗜酸性粒细胞数、气道管壁及平滑肌厚度、MMP-9及TIMP-1表达均明显高于正常对照组，多西环素干预组较正常对照组亦明显升高(P<0.01)。哮喘模型组MMP-9/TIMP-1低于正常对照组和多西环素干预组，多西环素干预组亦低于正常对照组(P<0.01)。结论多西环素可通过对MMP-9/TIMP-1平衡调节减缓哮喘的气道炎症和气道重塑。

[关键词]哮喘；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶组织抑制剂1

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.05.003

支气管哮喘(bronchial asthma)是由多种炎症细胞及炎症介质参与的气道慢性非特异性疾病。众多研究表明，基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)的平衡对气道重塑的影响最为明显[1-2]。多西环素除用于控制感染外，还具有免疫调节、抑制细胞因子合成、抑制MMPs活性的作用[3]。然而，多西环素对MMP-9与TIMP-1平衡的影响尚不明确，对哮喘气道炎症、气道重塑是否存在干预作用及其作用机制有待进一步证实。本研究通过多西环素干预哮喘大鼠模型，以MMP-9、TIMP-1作为主要观察指标，研究多西环素对MMP-9、TIMP-1平衡及气道重塑的影响，探讨其可能的作用机制，旨在为哮喘治疗提供新思路。

1材料与方法

1.1动物来源SD健康雄性大鼠33只，6周龄，体质量50~100 g，购自河北省实验动物中心，标准日粮和无菌饮用水，自由饮食。将所有大鼠按体质量从小到大排序，依照随机数字表给出的数据，从小到大排列，1~11为正常对照组，12~22为哮喘模型组，23~33为多西环素干预组，每组11只。

1.2实验方法

1.2.1模型的建立[4-5]哮喘模型组和多西环素干预组在实验的第1、8天向大鼠腹腔注射卵蛋白100 mg和氢氧化铝100 mg(混于生理盐水2 mL中)进行致敏。第15天起将待激发大鼠放于自制的、非完全密闭雾化吸入箱中，雾化吸入卵清蛋白溶液。溶液浓度从1%开始依次递增，之后为1.5%、2%、2.5%、3%，每4次激发后增加1次卵清蛋白浓度，每次30 min，隔日1次，共激发20次。待大鼠出现呛咳、烦躁、呼吸急促、活动量下降等症状表示激发成功。正常对照组以等量生理盐水代替卵清蛋白溶液。多西环素干预组在每次激发前30 min口腔灌服多西环素溶液，剂量为30 mg/kg[6]。大鼠末次激发24 h后，用1%戊巴比妥钠麻醉后处死并取材。

1.2.2取材将大鼠麻醉摘取右肺下叶组织，以4%甲醛溶液固定后保存，行病理切片及免疫组织化学；左侧肺组织行支气管肺泡灌洗，离心(4 ℃，1 000 r/min)10 min，进行细胞分类及计数。

1.3观察指标观察支气管肺泡灌洗细胞计数和分类、肺组织病理切片，免疫组织化学法检测肺组织MMP-9及TIMP-1的表达。

2结果

2.1肺组织病理切片HE染色结果正常对照组的大鼠肺组织病理切片可见支气管黏膜上皮、黏膜肌层、肺组织结构完整，支气管管腔规则,腔内未见炎性渗出物，气道周围偶见炎性细胞(图1A)。哮喘模型组大鼠肺组织病理切片可见支气管黏膜增厚、气道平滑肌明显增厚；气道周围、肺泡间质可见大量炎性细胞浸润(图1B)。多西环素干预组的支气管壁增厚程度、血管增生及炎性细胞浸润等均较哮喘模型组减轻(图1C)。

2.2支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中细胞计数及细胞分类的变化哮喘模型组BALF中的细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞均高于正常对照组(P<0.01)；多西环素干预组以上指标均较哮喘模型组明显下降(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.05)。见表1。

2.3气道管壁厚度和平滑肌厚度比较哮喘模型组管壁厚度和平滑肌厚度均高于正常对正常照组(P<0.01)；多西环素干预组以上指标均较哮喘模型组明显下降(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。见表2。

2.4MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比较哮喘模型组气道中MMP-9、TIMP-1均高于对照组(P<0.01)；多西环素干预组MMP-9、TIMP-1均较哮喘组明显下降(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。哮喘模型组和多西环素干预组MMP-9/TIMP-1均低于正常对照组(P<0.01)，哮喘模型组MMP-9/TIMP-1低于多西环素干预组(P<0.01)。见表3，图2，3。

表1　3组BALF中细胞计数及细胞分类比较Table 1　The number and class of cells in BALF among three groups

表1　3组BALF中细胞计数及细胞分类比较Table 1　The number and class of cells in BALF among three groups

组别细胞总数中性粒细胞淋巴细胞嗜酸性粒细胞正常对照组 9.42±3.670.23±0.141.18±0.381.24±0.72哮喘模型组 35.53±7.06*1.12±0.30*2.63±0.33*4.84±0.65*多西环素干预组14.66±5.81*#0.59±0.19*#2.05±0.58*#2.14±0.58*#F64.84045.00729.88190.598P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01与正常对照组比较#P<0.01与哮喘模型组比较(q检验)

表2　3组气道管壁厚度和平滑肌厚度比较Table 2　The airway wall thickness and smooth muscle thickness among three groups　

*P<0.01与正常对照组比较#P<0.01与哮喘模型组比较(q检验)

表3　3组气道中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比较Table 3　MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 expression in lung among three groups　

*P<0.01与正常对照组比较#P<0.01与哮喘模型组比较(q检验)

3讨论

MMPs是由20多种高度保守的锌、钙离子依赖蛋白内切酶组成，能分解几乎所有细胞外基质的蛋白成分。依据底物的不同，MMPs可分为明胶酶类、间质胶原酶类、基质溶解素、膜型MMPs及其他MMPs[7]。MMP-9属于明胶酶类，与哮喘的关系最为密切。MMP-9来源丰富，多种细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等均可产生MMP-9，但其产量较少，一般情况下难以检测[8]。在气道炎症发生、发展的过程中，MMP-9起到了重要的调节作用，它能促进中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等的渗出，加重炎症反应。研究表明，与野生型小鼠相比较，MMP-9基因敲除的小鼠在卵蛋白致敏后其BALF以及支气管周围淋巴细胞和单核细胞的表达明显减少，而野生小鼠在激发后表现出明显的气道高反应性，MMP-9相关的明胶含量增多[9]。从而证实MMP-9在气道炎症发展中起到了关键性作用。

盐酸多西环素为一种半合成四环素类抗生素，研究发现，多西环素对MMPs具有高效的抑制作用，通过封闭MMPs中的金属离子导致蛋白质结构的改变而使MMPs失去活性[9]。多西环素通过抑制MMPmRNA转录[10]或使酶原在细胞外激活过程中降解[11]的方式，降低了MMPs(MMP-2、MMP-9)活性可能是其作用机制之一。Gueders等[12]首次证实吸入多西环素可抑制过敏原诱导的气道高反应性，BALF及支气管周围的嗜酸性粒细胞浸润，预防过敏原诱导的支气管形态改变，可抑制腺体增生、气道壁和平滑肌层增厚和支气管旁胶原沉积。多西环素降低了小鼠肺组织的MMP-9和MMP-2的活性及MMP-9/ MMP-9蛋白的比值，推测多西环素可能通过抑制Th2细胞及MMP-9活性发挥其干预哮喘气道炎症及气道重塑的作用。Cataldo等[13]研究发现哮喘患者诱导痰中MMP-9水平升高，但TIMP-1水平无明显变化，引起MMP-9/TIMP-1失衡，从而导致MMP-9蛋白水解作用增强。目前对哮喘中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的关系问题尚未达成统一认识。部分研究表明一氧化氮在哮喘的气道重塑过程中起到了重要作用，而多西环素可减少诱生型一氧化氮合酶的表达，这可能是多西环素缓解气道重塑的潜在机制之一[14]。但多西环素通过对MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的调节，减轻气道炎症和气道重塑是值得肯定的。

目前，关于多西环素通过调节MMP-9、TIMP-1的表达，从而干预哮喘气道重塑的文献较少，本研究以此为切入点，希望能解释其作用机制。本研究结果显示哮喘模型组MMP-9、TIMP-1的表达较正常对照组明显升高；多西环素干预后，MMP-9、TIMP-1均呈下降趋势，对TIMP-1的调节更为明显，使MMP-9/TIMP-1较哮喘模型组有所升高。说明在哮喘过程中，TIMP-1过度表达，细胞外基质形成增加，出现管壁增厚、平滑肌增加等表现，MMP-9的表达也随之升高，从而导致气道的修复过度。多西环素干预后可下调TIMP-1的表达，减缓气道重塑。本研究中 MMP-9也呈下降趋势，这一变化可能是因为TIMP-1减弱而随之出现的相关变化。总之，多西环素可通过对MMP-9/TIMP-1平衡调节减缓哮喘的气道炎症和气道重塑。

综上所述，多西环素可通过降低TIMP-1的表达，调节MMP-9/TIMP-1的平衡，减少炎症细胞的浸润、细胞外基质沉积，减缓哮喘的气道重塑。但明确各个细胞因子之间的相互影响及其具体机制，仍需更加深入的研究。(本文图见封二)

[参考文献]

[1]Lee KS,Jin SM,Lee H,et al.Imbalance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in toluene diisocyanate-induced asthma[J].Clin Exp Allergy,2004,34(2):276-284.

[2]Ohbayashi H,Shimokata K.Matrix metalloproteinase-9 and airway remodeling in asthma [J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4(2):177-181.

[3]Bendeck MP,Conte M,Zhang M,et al.Doxycycline modulates smooth muscle cell growth,migration,and matrix remodeling after arterial injury[J].Am J Pathol,2002,160(3):1089-1095.

[4]Karakiulakis G,Papakonstantinou E,Aletras AJ,et al.Cell type-specific effect of hypoxia and platelet-derived growth factor-BB on extracellular matrix turnover and its consequences for lung remodeling [J].J Biol Chem,2007,282 (2):908-915.

[5]Palmans E,Kips JC,Pauwels RA.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt 1):627-635.

[6]Lee KS,Jin SM,Kim SS,et al.Doxycycline reduces airway inflammation and hyperresponsiveness in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma[J].J Allergy Clin Immuol,2004,113(5):902-909.

[7]Nagase H,Woessner JF Jr.Matrix metalloproteinases[J].J Biol Chem,1999,274(31):21491-21494.

[8]Atkinson JJ,Senior RM.Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,28(1):12-24.

[9]Cataldo DD,Tournoy KG,Vermaelen K,et al.Matrix metalloproteinase-9 deficiency impairs cellular infiltration and bronchial hyperresponsiveness during allergen-induced airway inflammation[J].Am J Pathol,2002,161(2):491-498.

[10]Atkinson JJ,Senior RM.Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,28(1):12-24.

[11]Sochor M,Richter S,Schmidt A,et al.Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with doxycycline reduces pancreatitis-associated lung injury[J].Digestion,2009,80(2):65-67.

[12]Gueders MM,Bertholet P,Perin F,et al.A novel formulation of inhaled doxycycline reduces allergen-induced inflammation,hyperresponsiveness and remodeling by matrix metalloproteinases and cytokines modulation in a mouse model of asthma[J].Biochem Pharmacol,2008,75(2):514-526.

[13]Cataldo DD,Bettiol J,No⊇l A,et al.Matrix metalloproteinase-9,but not tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,increases in the sputum from allergic asthmatic patients after allergen challenge[J].Chest,2002,122(5):1553-1559.

[14]Gabazza EC,Taguchi O,Tamaki S,et al.Role of nitric oxide in airway remodelling[J].Clin Sci (Lond),2000,98(3):291-294. KS,Jin SM,Lee H,et al.Imbalance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in toluene diisocyanate-induced asthma[J].Clin Exp Allergy,2004,34(2):276-284.

(本文编辑：许卓文)

[收稿日期]2014-11-28；[修回日期]2015-03-25

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题计划(20120248)

[作者简介]王亮(1979-)，男，河北石家庄人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事呼吸系统疾病诊治研究。 *通讯作者。E-mail:wlyc1111@sohu.com

[中图分类号]R562.25

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)05-0505-04

Effects of doxycycline on matrix metalloprotein 9/tissue inhibitor of metalloproteinases 1 balance in asthmatic rats

WANG Liang1，NI Wei-bo1,YANG Hong-shen2*

(1.Department of Respiratory Medicine,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;

2.Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of doxycycline on matrix metalloprotein 9(MMP-9)/ tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP-1)expression in asthmatic rats model for a novel way in clinical prevention of asthma.MethodsThirty-three SD male rats were randomly divided into three groups(11 rats a group): normal control group,asthma group and doxycycline intervention group.Doxycycline intervention group was gavaged with doxycycline before OVA challenge.MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue were observed by immunohistochemistry.ResultsThe expression levels of eosinophils and neutrophils in bronchial alveolar lavage fluid(BALF) of asthma group were significantly higher than those of control group and doxycycline intervention group ; the eosinophils of doxycycline intervention group was higher than that of control group.The airway wall and the smooth muscle in asthma group were significantly thicker than those of doxycycline intervention group and control group.The airway wall and the smooth muscle of doxycycline group were thicker than those of control group.The expression of MMP-9 and TIMP-1 in asthma group were significantly higher than those of control group and doxycycline group,and doxycycline group higher than control group(P<0.01).ConclusionDoxycycline can ameliorate airway inflammation and airway remodeling by decreasing the ratio of MMP-9/TIMP-1.

[Key words]asthma; matrix metalloproteinase 9；tissue inhibitor of metalloproteinases 1