4株高效产电菌的电化学活性及其生物学特征

滕 瑶， 王亚光， 费讲驰， 刘祝祥， 陈义光， 何则强*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.中南大学 冶金与环境学院，湖南 长沙 410083)



4株高效产电菌的电化学活性及其生物学特征

滕 瑶1， 王亚光1， 费讲驰2， 刘祝祥1， 陈义光1， 何则强1*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.中南大学 冶金与环境学院，湖南 长沙 410083)

采用循环伏安法对从湖南省吉首大田湾污水处理厂曝气池活性污泥中富集和筛选的37株产电菌的电化学活性进行考察。结果发现，4株菌株(F012、F015、F021、F026)的电化学活性较为显著，其中F026的电化学活性最好。对4株产电菌的系统发育分析表明，菌株F012属于Dyella属，与DyellamarensisCS5-B2T系统发育关系最为密切(相似性为97.22%)；菌株F015属于Paludibacterium属，与该属的Paludibacteriumyongneupense5YN8-15T系统发育关系最为密切(相似性为97.70%)；菌株F021和F026都属于Pseudomonas属，分别与该属的PseudomonassimiaeOLiT和PseudomonasotitidisMCC10330T系统发育关系最为密切(相似性分别为99.60%和98.62%)。生物学特性研究表明，电化学活性最好的产电菌F026的生长温度范围为20～40 ℃，最适宜生长温度为30～35 ℃；生长pH范围为5～9，最适pH生长范围为8～9，适合作为微生物燃料电池的高效产电菌。

微生物燃料电池；产电菌；电化学活性；生物学特性

作为一种新型的绿色可再生能源利用技术，微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell，MFC)由于其在有效处理废水的同时可以产生电能，近年来引起研究者们的广泛关注[1-4]。MFC是一种利用产电微生物(Electricigen，又称产电菌)将有机物或无机物中的化学能转化为电能的新型能源转换装置。MFC产电基本原理为，产电菌富集在阳极，降解有机物所产生的电子传输到阳极，再通过外电路负载到达阴极，由此产生外电流；产电菌降解有机物所产生的质子则从阳极室通过分隔材料到达阴极，在阴极上与电子、氧气反应生成水，从而完成MFC内电荷的传递[5-8]。在MFC整个产电过程中，起决定作用的是电子在阳极区的传递，其中能够利用有机物维持生长，氧化有机物，并将获得的电子传递到阳极的微生物即称为产电菌。产电菌传递电子的过程是MFC实现能量转换的关键步骤，也是MFC整个产电过程的决速步骤[9]。由于不同的产电菌的产电能力差异很大，产电菌对MFC的功能与应用起着决定作用，被认为是MFC 体系的核心。现有研究已经表明，具有电化学活性的产电菌呈现多样性[10-12]，而利用分子生物学手段分析中国地区阳极生物膜的优势菌群，所得结果中极少见到已有文献报道的已分离出的菌属[13-15]，说明不同地域有不同种类的优势产电菌群，不同种类产电菌产电机制也可能因不同的代谢机制而呈现不同的类型。因此运用富集、培养、分离、纯化等手段筛选出产电菌，并获得本区域主要的优势产电菌群，对于研究MFC产电机制、优化MFC产电模型具有重要的理论与实践意义。本课题组利用湖南省吉首市大田湾污水处理厂曝气池中的污泥进行富集培养，应用纯培养法分离纯化得到了37株产电菌[16]，对其产电性能进行了研究[17]。本研究采用循环伏安法对分离得到的菌株进行电化学活性筛选，并对筛选得到的4株电化学活性显著的产电菌的形态特征、生理生化特征进行分析，以期为高效产电菌的分离及其在MFC中的应用提供一定的理论依据和实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 所用菌种由本课题组对湖南省吉首市某污水处理厂曝气池的产电菌富集、分离、培养和保藏[16]。

1.1.2 培养基 培养基参照文献[16]进行配制，富集采用NB培养基，而分离、培养和保藏采用NA培养基。

1.1.3 主要试剂和仪器 万用表(UT800，优利德)；PCR仪(PE29600型，BIO-RAD公司)；电化学工作站(CHI660B，上海辰华)；玻碳电极(GC130，天津艾达恒晟)；铂电极(Pt005，天津艾达恒晟)；Ag/AgCl 电极(R0302，天津艾达恒晟)；电解池(C001，天津艾达恒晟)。生理生化分析常用试剂同文献[18]，PCR引物、PCR 常规操作所用试剂和酶均由上海生工生物工程有限公司提供，其他试剂和仪器均购自湖南邵阳科学仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的电化学活性筛选 为了测定分离所得菌株的电化学活性，将菌株放入已灭菌的NA液体培养基中，置入厌氧培养箱于28 ℃条件下培养48 h后取20 mL菌悬液，经离心、清洗后重悬于50 mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液中。以玻碳电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，在CHI660B电化学工作站上进行循环伏安测试。测试时为保持厌氧条件，测试体系置于高纯氮气中，扫描速率为0.002 V/s、扫描电压范围为-1.0～0.6 V。

1.2.2 菌株生物学特征分析 形态观察、培养条件、生理生化特性等生物学特征按文献[19]推荐方法进行；革兰染色用传统染色法[20]和KOH法[21]进行。

1.2.3 16S rRNA 基因序列测定和系统发育分析 总DNA提取、16S rRNA 基因的PCR扩增、PCR产物纯化和序列测定参照文献[22]进行。根据测序结果提交到GenBank注册，从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA 基因序列。用CLUSTAL.X 软件进行多重对比[23]，用MEGA 3.1软件包采用邻接法(Neighbor-joining method)进行聚类分析，进行同源性比较并构建系统发育树[24]。

2 结果与分析

2.1 菌株的电化学活性

在MFC研究中，常用循环伏安法来表征微生物菌株和菌群的电化学活性[25-27]，或者被用来判断体系中是否存在由微生物产生的电子穿梭体或电子介体[28]。本研究采用循环伏安法对从剩余污泥中富集分离的菌株的电化学活性进行考察，以筛选出电化学活性较好的产电菌。结果表明，在52株菌受试中有37株菌具有不同程度的电化学活性，其中4株菌的电化学活性表现较为显著，分别是F012、F015、F021和F026。图1为4株菌的循环伏安曲线。为了比较，对没有添加产电菌的体系的循环伏安也进行了测定[1]。图1表明，没有添加产电菌的体系，循环伏安曲线近似为一条电流为0的直线，说明该体系本身基本没有电化学活性。而添加了产电菌的各体系的循环伏安曲线都体现出一定的氧化还原峰，表明各产电菌具有不同程度的电化学活性[1]。其中F012的循环伏安曲线包围的面积最小，而F026的面积最大，说明在所研究的4株产电菌中F026具有最优的电化学活性，可能适合作为微生物燃料电池的产电菌。

图1 4株产电菌的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammetry curves of the four electricigens

2.2 产电菌的生物学特征

对4株电化学活性较好的菌株进行培养特征、形态特征和生理生化特征等部分主要生物学特性的观察，结果见表1。由表1可知，4株高产电活性菌株均为革兰阴性、无芽胞菌，均能水解尿素，但都不能水解淀粉和酪素；各产电菌最适生长温度在25～35 ℃之间，最适pH生长范围为7～9。其中电化学活性最好的产电菌F026的最适生长温度为30～35℃，最适pH生长范围为8～9。

表1 4株电化学活性较强的产电菌的生物学特性

Table 1 Biological characteristics of four electricigens with good electrochemical activities

特征F012F015F021F026菌落颜色乳白色浅粉色浅黄色淡黄色细胞形态杆状球状杆状杆状生长温度/℃温度范围15～305～3015～3520～40最适温度252520～3030～35生长pH值pH范围5～95～95～105～9最适pH7～87～98～98～9多聚物水解明胶---++吐温-20+W--吐温-40+--+吐温-60+W-+吐温-80+--+

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性；“W”代表微弱阳性

2.3 基于16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析

对菌株F012、F015、F021、F026的16S rRNA基因进行了PCR、纯化和序列测定，并进行了系统发育分析，系统进化树见图2。结果表明，菌株F012属于Dyella属，与DyellamarensisCS5-B2T系统发育关系最为密切(相似性为97.22%)；菌株F015属于Paludibacterium属，与该属的Paludibacteriumyongneupense5YN8-15T系统发育关系最为密切(相似性为97.70%)；菌株F021和F026均属于Pseudomonas属，分别与该属的PseudomonassimiaeOLiT和PseudomonasotitidisMCC10330T系统发育关系最为密切(相似性分别为99.60%和98.62%)。

根据图2的系统发育分析结果，采用16S rRNA 基因序列相似性大于97%的菌株属于同一物种的归类原则[23]，分离的菌株与其相关有效发表种的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在97.22%～99.60%之间，说明菌株与其系统发育关系最密切的相关菌株间存在较大的遗传差异。

图2 4株产电菌及其从GenBank等数据库中调集的相关属种构建的以16S rRNA基因序列为基础的系统树状关系图Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed showing the phylogenetic relationships among four electricigens and other related strains from GenBank based on 16S rRNA gene sequence

3 讨 论

产电菌具有丰富的物种多样性。已在细菌域、古菌域和真核生物域中发现产电菌，随着研究的深入，发现的产电菌种类会不断增加。本研究以污水处理厂的剩余污泥为反应物，对其中产电菌进行富集和筛选，采用循环伏安法对各产电菌的电化学性能进行评价。通过基于16S rRNA 对电化学活性较强的产电菌进行基因序列的系统发育多样性的分析，并对其进行生理生化分析对比。研究表明，从剩余污泥中富集分离得到的52株产电菌中有37株具有一定的电化学活性，其中4株产电菌(F012、F015、F021和F026)电化学活性较强，而F026电化学活性最强。4株产电菌的最适生长温度在25～35 ℃之间，最适pH生长范围为7～9，其中F026的最适生长温度为30～35 ℃，最适pH生长范围为8～9。研究结果说明F026可在30～35 ℃和弱碱性条件下生长，并体现出最好的电化学活性，有望应用于MFC中。由于产电菌是MFC的核心，如何通过选育优质产电菌并优化其生长条件，对MFC在废水处理中的应用及其产电性能的提高具有重要意义。

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Electrochemical Activities of Four Efficient Electric-Producing Bacteria & Their Biological Characteristics

TENG Yao1, WANG Ya-guang1, FEI Jiang-chi2, LIU Zhu-xiang1, CHEN Yi-guang1, HE Ze-qiang1

(1.Coll.ofBio-Res. &Environm’lSci.,JishouUni.,Jishou416000; 2.Schl.ofMetallurgy&Environm’t,CentralS.Uni.,Changsha410083)

Electrochemical activities of 37 electric-producing (EP) bacterial strains were enriched and screened from an aerator in Datianwan Sewage Treatment Plant located in Jishou city, Hunan Province. They were studied using cyclic volta-ampere technique. It was found in the results that four EP strains (F012, F015, F021 and F026) had fairly obvious electrochemical activities, among them strain F026 had the best. The phylogentic analyses of the four EP strains indicated that strain F012 was closely related to genusDyellawith 16S rRNA gene sequence similarity at 97.22% (DyellamarensisCS5-B2T); and strain F015 belonged to the genus ofPaludibacterium, and had the closest relation toPaludibacteriumyongneupense 5YN8-15Tof the genus with 16S rRNA gene sequence similarity at 97.70%. Strains F021 and F026 belonged to the genus ofPseudomonas, and had the closest relation toPseudomonassimiaeOLiTandPseudomonasotitidisMCC10330Twith 16S rRNA gene sequence similarity at 99.60% and 98.62% respectively. The results of biological characteristics showed that strain F026 had the best electrochemical activity and grew well at 20～40 ℃, with optimal temperatures at 30～35 ℃, pH range at 5～9 with optimal pH at 8～9, suggesting F026 is a promising efficient EP strain for microbial fuel cell (MFC).

microbial fuel cell (MFC); electric-producing bacteria; electrochemical activities; biological characteristics

国家自然科学基金项目(51262008，51472107)；湖南省自然科学基金项目(12JJ2005)；湖南省科技计划重

滕瑶 女，硕士研究生。从事微生物燃料电池研究。E-mail:tell1030@126.com

* 通讯作者。男，博士，教授，硕士生导师。主要从事功能材料和废物资源化利用研究。E-mail:csuhzq@163.com

2014-12-22；

2015-03-25

Q939.1

A

1005-7021(2015)06-0027-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.005

点项目(2012GK2017)；湖南省重点学科建设项目(JSU0713)