1株产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌噬菌体分离和生理特性初步研究

刘 勇， 马玉岳， 徐友强， 裴疆森， 姜国政， 姜增妍， 程 池*

(1.中国食品发酵工业研究院，北京 100015；2.山东省富马酸生物转化工程技术研究中心，山东 烟台 265709；3.烟台恒源生物股份有限公司，山东 烟台 265709)



1株产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌噬菌体分离和生理特性初步研究

刘 勇1,2， 马玉岳2,3， 徐友强1,2， 裴疆森1，2， 姜国政2,3， 姜增妍2,3， 程 池1,2*

(1.中国食品发酵工业研究院，北京 100015；2.山东省富马酸生物转化工程技术研究中心，山东 烟台 265709；3.烟台恒源生物股份有限公司，山东 烟台 265709)

对产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌噬菌体进行分离和生理特性研究，有助于为生产过程中噬菌体污染的防治提供指导。采用双层平板法对噬菌体进行分离纯化。利用透射电镜观察噬菌体形态。进行噬菌体全基因组测序和比对。通过测定不同处理条件下噬菌体活性，研究温度、pH、有机溶剂氯仿、去垢剂SDS对噬菌体的影响。从噬菌体污染的L-天冬氨酸酶生产菌种大肠埃希菌HY-05C发酵培养液中分离出1株噬菌体。电镜结果表明，该噬菌体由呈多面体对称的头部和极短的尾部构成。基因组测序和比对结果表明，噬菌体与T7样噬菌体的相似性最高。生理特性研究表明，噬菌体对高温和去垢剂SDS敏感，对有机溶剂氯仿不敏感；最适pH为7.0，碱性条件下活力较为稳定，酸性条件容易失活。噬菌体保藏编号为CICC 80001。

噬菌体；生理特性；大肠埃希菌；L-天冬氨酸酶

工业规模微生物发酵生产L-天冬氨酸酶中的噬菌体污染是一个常见现象，对工业生产具有巨大的危害性。目前，鲜见关于L-天冬氨酸酶生产过程中污染噬菌体分离和生理特性相关的研究报道。大肠埃希菌HY-05C (EscherichiacoliHY-05C)是1株性能优良的L-天冬氨酸酶生产菌株，其L-天冬氨酸酶活力高达4 500 U/mL，能够高效转化富马酸生产L-天冬氨酸[1]。本研究从噬菌体污染的HY-05C发酵液中分离纯化出1株噬菌体，通过透射电镜观察噬菌体形态，并对其生理特性(温度、pH、有机溶剂和去垢剂)对噬菌体活性的影响进行研究，以期为L-天冬氨酸生产过程中噬菌体污染的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 噬菌体污染的大肠埃希菌HY-05C发酵液，采集于工厂L-天冬氨酸生产车间发酵罐。

1.1.2 菌种 大肠埃希菌HY-05C，为噬菌体宿主菌。

1.1.3 培养基 LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠5，pH 7.0。固体培养基则添加琼脂(20 g/L)。

1.1.4 试剂 氯仿、SDS等均为国产分析纯。

1.1.5 仪器与设备 恒温培养箱GHP-9270(上海)，恒温水浴锅HH-3A(天津)，透射电镜JEM-1400(日本)，高通量测序仪Illumina Hiseq 2000(美国)。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体分离和纯化 将噬菌体污染的HY-05C发酵液摇匀过0.22 μm滤膜，取100 μL发酵液于900 μL无菌水中摇匀，依次进行梯度稀释。取100 μL稀释液与900 μL处于对数生长期的宿主菌HY-05C混匀，再取100 μL混合液采用双层平板法[2]分离，37 ℃倒置培养16 h。用无菌牙签挑取单个噬菌斑。噬菌斑连续5代单斑穿刺纯化培养[3]。当噬菌斑形态和大小基本稳定时，可认为噬菌体已被纯化。

1.2.2 噬菌体培养[4]将宿主菌HY-05C接种于LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养至对数生长期(OD600为0.6左右)，挑取单个噬菌斑接种处于对数生长期的宿主菌，37 ℃静置培养3 h，再37 ℃、180 r/min培养至培养液变透明，得到噬菌体悬液。

1.2.3 噬菌体滴度测定 取100 μL噬菌体悬液，加入900 μL无菌水中摇匀，依次进行梯度稀释。取10-3～10-5稀释梯度的稀释液100 μL与900 μL处于对数生长期的宿主菌HY-05C混匀，取100 μL采用双层平板法37 ℃倒置培养16 h，对噬菌斑进行计数[5]。

1.2.4 噬菌体显微形态观察 采用醋酸双氧铀染色法，取100 μL噬菌体CICC 80001悬液，滴在石蜡片上，将铜网放置于噬菌体悬液液滴上，5 min后将铜网取下，置于干净的滤纸上晾干。用2%(质量分数)醋酸双氧铀染色10 min，将铜网取下晾干，透射电镜观察[6-7]基本形态。

1.2.5 噬菌体基因组提取和测序 噬菌体DNA提取参考文献[8]，噬菌体基因组通过Illumina Hiseq 2000系统进行测序，并利用软件CLC Genomics Workbench 5.0.1进行拼接[9]。

1.2.6 噬菌体温度稳定性[10]将噬菌体悬液(滴度为7.8×107pfu/mL)分别置于50、65、80、95 ℃的水浴锅中，10、20、30、40 min分别取样，立即将样品置于4 ℃冰箱中冷却，样品稀释后取合适的梯度测定各温度下不同作用时间噬菌体的滴度。

1.2.7 噬菌体pH耐受性[10]取无菌EP管分别加入不同pH值(3、5、7、9、11)的LB培养基900 μL，然后将上述EP管置于37 ℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入100 μL噬菌体悬液(滴度为7.8×107pfu/mL)，恒温1 h。将样品做适当稀释，按1.2.3测定噬菌体滴度。

1.2.8 噬菌体对有机溶剂氯仿和去垢剂SDS的敏感性[6]室温下将噬菌体悬液(滴度为7.8×107pfu/mL)与氯仿混合，氯仿体积分数为25%，震荡5 min后6 000 r/min离心1 min，按1.2.3测定噬菌体滴度。噬菌体悬液加入质量分数为0.1%的SDS，室温下放置5 min，按1.2.3测定噬菌体滴度。

2 结果与分析

2.1 噬菌体分离和纯化

从噬菌体污染的L-天冬氨酸酶生产菌种大肠埃希菌HY-05C发酵液中分离得到1株噬菌体，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 80001，噬菌斑透明，边缘清晰，无晕环，呈现典型裂解型噬菌体特征，培养16 h，噬菌斑直径为3～4 mm。

2.2 噬菌体显微形态观察

利用透射电镜观察(图1)，噬菌体CICC 80001由直径50～60 nm呈正多面体对称的头部和极短的尾部构成。从形态上，CICC 80001属于C1形态群；依据ICTV病毒分类第8次报告，CICC 80001属于有尾噬菌体目 (Caudoviradles)，短尾噬菌体科 (Podoviridae)。

2.3 噬菌体全基因组测序

测序结果表明，噬菌体CICC 80001基因组(GenBank登录号为KM242061.1)全长38 810 bp，G+C含量为48.8%。与NCBI已公布的近缘噬菌体全基因组进行比对，CICC 80001与T7样噬菌体的相似性最高，但仅有83.7%。由于相似性较低，且在系统发生树上单独聚为一支，表明噬菌体CICC 80001可能为1株新的噬菌体(图2)。

图1 噬菌体CICC 80001电镜照片Fig.1 Transmission electron micrograph of phage CICC 80001

图2 噬菌体CICC80001系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of phage CICC80001

The tree was constructed with the MEGA 5.2 program using neighbour-joining cluster algorithm. The numbers at the branches are bootstrap values.

2.4 噬菌体温度稳定性

温度稳定性结果(图3)表明，随着温度的升高和作用时间的延长，噬菌体存活率降低。噬菌体CICC 80001于80 ℃处理40 min后，96%失活；95 ℃处理10 min，全部失活。

2.5 噬菌体pH耐受性

由图4可知，噬菌体CICC 80001在pH 7.0时最为稳定。pH的升高对噬菌体活性影响不明显，pH降低对其活力影响显著，pH为3.0时CICC 80001活力下降显著。

图3 温度对噬菌体CICC 80001活性的影响Fig.3 Effect of temperature on the viability of phage CICC 80001

图4 pH对噬菌体CICC 80001活性的影响Fig.4 Effect of pH on the viability of phage CICC 80001

2.6 氯仿和SDS对噬菌体活性的影响

选取氯仿和SDS对噬菌体进行处理，研究其对化学试剂的敏感性。结果表明，噬菌体CICC 80001对有机溶剂氯仿不敏感，用体积分数为25%的氯仿处理后活力仍能维持在82%左右；而对去垢剂SDS较敏感，用质量分数为0.1%的SDS处理后，活力仅剩48%(图5)。噬菌体对0.1% SDS较为敏感，可能是由于SDS与噬菌体外壳蛋白结合，从而影响其对宿主菌的侵染。

图5 氯仿和SDS对噬菌体CICC 80001活性的影响Fig.5 Effect of chloroform and SDS on the viability of phage CICC 80001

3 讨 论

L-天冬氨酸酶生产菌种大肠埃希菌HY-05C发酵培养过程中，发生噬菌体污染时常表现为菌种生长缓慢，严重时甚至不生长；或发酵液培养到一定阶段，菌体生长停止，同时温度下降，产生大量泡沫。被噬菌体污染的发酵液无L-天冬氨酸酶活力或活力较低，严重影响生产。本研究从产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌HY-05C发酵液中分离得到的噬菌体CICC 80001，头部呈正多面体对称，直径50～60 nm，并有很短的尾部，结合系统发育分析，噬菌体CICC 80001属短尾噬菌体科噬菌体。噬菌体的分离及系统发育分析为后续抗性菌种的选育奠定了基础。

通过温度对噬菌体CICC 80001活性影响研究表明，噬菌体对高温比较敏感，95 ℃处理10 min，噬菌体全部失活。因此，生产中可利用蒸汽为热源，通过加热器对进入发酵罐中的空气进行加热，以灭活其中可能带有的噬菌体。

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Bacteriophage Strain against L-Aspartase Producing Escherichia coli

LIU Yong1, 2, MA Yu-yue2, 3, XU You-qiang1,2, PEI Jiang-sen1,2, JIANG Guo-zheng2, 3, JIANG Zeng-yan2, 3, CHENG Chi1, 2

(1.ChinaNat'lRes.Inst.ofFood&Ferment'nIndust.,Beijing100015; 2.YantaiHengyuanBio-Engin.Co.,Ltd,Yantai265709; 3.ShandongEngin.TechnologyRes.CtrForFumaricAcidBiotransf.,Yantai265709)

Carry out isolation and physiological characteristics study on the bacteriophage against L-aspartase producingE.coliconduces to control the phage contamination during the production process. The phage was isolated and purified adopting double-layer plate method. And the phage morphology was determined using transmission electron microscopy (TEM). The phage omni-genome was sequenced and compared with gene bank. The effects of temperature, pH, organic solvent chloroform and detergent SDS on phage was determined by measuring the phage activity under different treatment conditions. A bacteriophage was isolated from L-aspartase producingE.colistrain HY-05C culture broth with phage contamination. The bacteriophage had a symmetrical head of regular polygon and short tails. Genome sequence and comparison results showed that it had a close relationship with T7 like bacteriophage. Research of the bacteriophage physiological characteristics showed that it was sensitive to high temperatures and SDS, but insensitive to chloroform, fairly stable in pH 7.0 and alkaline conditions, however, unstable under acidic condition.Bacteriophage preservation number is CICC 80001.

bacteriophage; physiological characteristics;E.coli；L-aspartase

烟台市科技计划项目(2014SF151)

刘勇 男，工程师。主要从事微生物学与发酵工程研究。Tel：010-53218288-6356，E-mail: hk2098@163.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。主要从事微生物学研究。E-mail: cheng100027@163.com

2014-10-11；

2014-11-21

Q93-31

A

1005-7021(2015)05-0043-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.008