黄芩抗蕃茄晚疫病菌抑菌成分的提取条件优选

李晓娟，李正英

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010000；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

黄芩抗蕃茄晚疫病菌抑菌成分的提取条件优选

李晓娟1，李正英2*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010000；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

采用恒温水浴浸提法，以无水乙醇作为提取溶剂，研究了提取时间、提取温度、料液比及提取次数对黄芩粗提物抗蕃茄晚疫病菌抑菌效果的影响。正交试验确定了最佳提取工艺条件为温度65℃，提取时间1.0 h，料液比1∶45（g∶m L），浸提2次，此时抑菌圈直径为34.3 mm。最小抑菌浓度为15.7 mg/m L。

黄芩；蕃茄晚疫病菌；提取工艺；最小抑菌浓度

黄芩（Scutellaria baicalensis）为唇形科多年草本植物黄芩的根，别名黄金茶或空心草，为常用中药，性寒味苦[1]。产于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古、黑龙江等地，具有清热解毒等作用[2]。研究表明，黄芩中主要有效成分为黄酮类化合物[3]。蕃茄晚疫病原菌（Phytophthora infestans）属于致病疫菌，它是世界蕃茄和马铃薯生产的巨大病害之一。由于其潜伏期短，侵染力强，传播速度非常快，常给农业生产带来巨大损失[4]。然而，现今使用的农药大多为有机磷农药，残留大，对人类的健康有很大的伤害。

目前，世界各国对植源性成分的提取分离及其抑菌机制等进行了大量的研究[5-7]。其中，已报道的具有抑菌作用或有协同抑菌作用的中药有效成分有很多，其中黄酮类化合物是一种生物活性很高的物质[8]。关于提取多种中草药的有效成分及其抑菌机理的报道还有很多[9-10]，一般来说，中草药性温，无残留，对人体没有伤害，并且易于购买，价格低廉。因此，提取其中的有效成分来开发天然抑菌剂来代替现有的农药是一个很好的途径。

本研究对于黄芩的提取采用溶剂提取法[11]，对于黄芩中有效成分的提取工艺优选采用单因素试验和正交试验相结合，抑菌活性检测采用牛津杯法[12]，以期为黄芩作为天然抑菌剂的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芩（Scutellaria baicalensis）：呼和浩特市京远大药房；蕃茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）：内蒙古农业大学职业技术学院食品工程技术系微生物实验室保存并提供；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇均为分析纯：天津市化学试剂三厂；马铃薯葡萄糖琼脂培养基及马铃薯葡萄糖培养基：青岛高科园海博生物技术公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-40型立式电蒸汽压力灭菌器：上海申安医疗器械厂；RE-52AAA型旋转蒸发仪：上海嘉鹏科技有限公司；VD-1320型无菌操作台：哈尔滨东联电子公司；MJX-150BX型霉菌培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；THZ-98AB型恒温振荡器：上海一恒科技有限公司；DDS-11A型数显电导率仪：上海雷磁新径仪器有限公司；SC-04型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

将蕃茄晚疫病原菌接种于灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上，28℃培养72 h，活化3次，将第三代菌种采用平板计数法，用灭菌后的生理盐水稀释成1×106CFU/m L的菌悬液[13]。

1.3.2 黄芩中抑菌物质的提取工艺流程

称取黄芩干粉5 g→置于250 mL三角瓶中→加入提取溶剂→水浴恒温浸提→真空抽滤→收集第一次滤液→收集沉淀→加入溶剂→第二次水浴恒温浸提→真空抽滤→收集滤液→合并二次滤液→旋转蒸发至干→加入10 m L蒸馏水溶解→冷冻干燥得粉末[14]

将干燥后的粉末0.5 g溶于5 m L蒸馏水中，制备抑菌液待用。

1.3.3 抑菌方法

采用牛津杯法[12]。配制马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，121℃高压灭菌20 min，冷却至60℃后倒入灭菌后的培养皿，待培养基凝固后加入200 μL菌悬液，涂布棒涂布均匀。将灭菌后的牛津杯置于培养皿中，向其中注入200 μL抑菌液，霉菌培养箱内28℃培养3 d，测量抑菌圈直径大小并记录，平行3次，取平均值。

抑菌圈直径（mm）=测量值-牛津杯直径

1.3.4 抑菌物质提取工艺

提取溶剂的选择：称取5.00g黄芩干粉，依次加入以下溶剂：乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正丁醇、体积分数分别为20%、40%、60%、80%的乙醇、无水乙醇、水，料液比1∶20（g∶m L），40℃条件下水浴恒温提取，进行抑菌实验，测量抑菌圈的大小选取最佳溶剂，平行3次，取平均值。

提取温度的选择：称取5.00 g黄芩干粉，加入选取的最佳溶剂，料液比1∶20（g∶m L），分别在20℃、35℃、50℃、65℃及75℃条件下水浴提取，进行抑菌实验，测量抑菌圈的大小选取最适温度，平行3次，取平均值。

料液比的选择：称取5.00 g黄芩干粉，加入选取的最佳溶剂，在选取的最适温度条件下水浴提取，料液比分别为1∶30、1∶35、1∶40、1∶45及1∶50（g∶m L），进行抑菌实验，测定抑菌圈的大小选取最适料液比，平行3次，取平均值。

提取时间的选择：称取5.00 g黄芩干粉，加入最佳溶剂，在最适的料液比，最适温度条件下分别提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h及3.0 h，进行抑菌实验，测定抑菌圈的大小选取最佳提取时间，平行3次，取平均值。

浸提次数的选择：称取5.00 g黄芩干粉，参照先前选取的最适条件，分别水浴提取1、2、3、4次，进行抑菌实验，测定抑菌圈的大小选取最佳浸提次数，平行3次，取平均值。

正交优化试验：选取影响提取效率的因素提取温度（A）、提取料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D），根据以上单因素的试验结果通过L16（44）的正交试验[15]，比较不同处理的抑菌效果来确定最佳提取条件。

1.3.5 最小抑菌浓度的测定

采用药液和培养基混合法[16]。将粗提物冷冻干燥成粉末状，采用二倍稀释法[17]，配制系列梯度：125.0 mg/m L、62.5mg/m L、31.3mg/m L、15.7mg/m L、7.9mg/m L、4.0mg/m L、2.0 mg/m L、0。每个培养皿中加入2 m L药液和18 m L PDA培养基，混合均匀，待其凝固后，加入200 μL菌悬液，涂布均匀，置于霉菌培养箱内，28℃培养3 d，观察是否长出菌落，未长出菌落的最小浓度即为最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优选

由图1可知，石油醚提取液的抑菌圈直径为0，除无水乙醇外提取液的抑菌圈直径在20～30 mm，无水乙醇作为提取溶剂时其抑菌圈直径为30.7 mm。根据溶质的相似相溶[11]原理，结构相似的物质才能易于混溶，因此选择无水乙醇作为最佳提取溶剂。

图1 溶剂对粗提物抑菌效果的影响Fig.1 Effects of different solvents on antibacterial results of extrac ting so lution

2.2 提取温度的选择

图2 不同提取温度对提取液抑菌效果的影响Fig.2 Effects of different temperature on antibacterial results of extracting solution

由图2可知，随着提取温度的增高，抑菌效果逐渐增强，但不是温度越高越好。因为无水乙醇的沸点是80℃左右，在提取过程中会大量蒸发掉，所以选择75℃作为最佳提取温度。

2.3 料液比的优选

图3 不同料液比对提取液抑菌效果的影响Fig.3 Effects o f different solid-liquid ratio on antibacterial results of extracting solution

由图3可知，随着提取溶剂用量的增加，物料与溶剂的接触面积增大，有效成分的浸出也随之加快，抑菌活性增强。当料液比在1∶40～1∶50（g∶m L）时，抑菌效果逐渐趋于稳定，料液比达到1∶45（g∶m L）时抑菌圈的直径最大为30 mm。因此，选择1∶45（g∶m L）作为最适宜的料液比。

2.4 提取时间的优选

图4 不同提取时间对提取液抑菌效果的影响Fig.4 Effects o f different extracting time on antibacterial results of extracting solution

由图4可知，提取时间为0.5～2.0 h时，随提取时间的延长，提取液的抑菌效果逐渐增加，而在2.0～3.0 h时，提取时间越长，提取液的抑菌效果越差，表明其抑菌物质可能被分解。因此选择2.0 h作为最佳提取时间。

2.5 浸提次数的优选

由图5可知，当提取次数为1～2次时，随着提取次数的增多，抑菌效果也逐渐增高。当提取次数为2～4次时，随着提取次数的增加，提取液的抑菌效果逐渐趋于平缓。当提取次数3次时，其抑菌圈的直径达到了28.7 mm。所以选择3次作为最适宜的提取次数。

图5 不同提取次数对提取液抑菌效果的影响Fig.5 Effects of different extraction times on antibacterial results of extracting solution

2.6 提取条件优化正交试验

通过采用正交设计，确定了提取条件的最优组合。正交试验结果与分析见表1，方差分析见表2。由表1可知，各因素的R值大小顺序为RA＞RC＞RD＞RB，即各因素对蕃茄晚疫病菌抑制效果影响的主次关系为提取温度（A）＞提取时间（C）＞提取次数（D）＞料液比（B）。综合考虑各因素对蕃茄晚疫病原菌的影响效果，确定了最佳配方组合为A2B3C1D2，即最佳提取温度为65℃，最佳提取时间为60m in，最佳料液比为1∶45（g∶m L），最佳提取次数为2次。在此最佳条件下进行验证试验，抑菌圈直径为34.3 mm。

表1 提取条件优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，4个因素对结果的影响均不显著。

2.7 最小抑菌浓度试验

以已知的试验结果为基础，进行最小抑菌浓度的测定。通过观察，粗提液质量浓度为31.3～125mg/m L，平板内皆无菌落生长；粗提液浓度为15.7mg/m L时，平板内出现极少数菌落；粗提液质量浓度为0～7.9 mg/m L，菌落数量随粗提液质量浓度的减少不断增加。因此，确定15.7 m g/m L为黄芩粗提液的最小抑菌浓度。

3 结论

通过对黄芩抗蕃茄晚疫原菌有效成分提取条件的研究结果表明，以无水乙醇作为黄芩的提取溶剂，65℃水浴提取1.0 h，料液比为1∶45（g∶m L），提取次数为2次时，黄芩粗提物的抑菌效果最佳，此时抑菌圈直径为34.3 mm。黄芩粗提液对蕃茄晚疫病原菌的最小抑菌浓度为15.7 mg/m L。由此可知，黄芩粗提液中的有效成分对于蕃茄晚疫病菌有一定的抑菌作用，可以为开发黄芩天然抑菌剂提供很好的理论基础。

[1]滕占才，王波，梁英.黄芩中黄芩苷常规回流浸提工艺优化研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（1）：70-73.

[2]王娜，黄晓伟，赵书豪，等.黄芩提取物的制备及其有效成分的测定[J].香料香精化妆品，2011（6）：21-24.

[3]史高峰，张兴潜，祝娟娟，等.黄芩总黄酮提取工艺的优化[J].应用化工，2011，40（11）：1973-1979.

[4]宋琳琳，李正英，陈萍.五倍子抗蕃茄晚疫病原菌有效成分提取工艺研究[J].食品工业科技，2013，34（10）：269-271.

[5]吴宗泽.巴天酸模中大黄素抗真菌机理的研究[D].长春：吉林大学硕士论文，2010.

[6]ITO H,UCHIYAMA S,TABE N,et al.CD and UV absorption bandshapes of DNA-acridime orange complexes:Influence of the interactions of purine-pyrimidine base pairs with dyes in intercalated model complexes[J].Chem Phys Lett,1989,162(12):103-109.

[7]孙为屹.大蒜素对家禅病原真菌抑菌作用及机理的研究[D].合肥：安徽农业大学硕士论文，2006.

[8]陈禹先，周彤，谢鲲鹏，等.黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌机制的研究[J].畜牧兽医学报，2013，44（12）：2000-2006.

[9]云宝仪，周磊，谢鲲鹏，等.黄芩素抑菌活性及其机制的初步研究[J].药学学报，2012，47（12）：1587-1592.

[10]曾超珍，刘志祥，韩磊.黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究[J].时珍国医国药，2009，20（6）：1342-1343.

[11]卢艳花.中药有效成分提取分离技术[J].北京：化学工业出版社，2005.

[12]李正英，张保军，陈忠军.杂交瓠瓜中抑菌物质提取条件的优选[J].食品科学，2007，28（8）：209-212.

[13]李正英，张保军，陈忠军，等.杂交瓠瓜中抗菌组分的分离及其抗菌活性研究[J].食品科学，2008，29（10）：112-114.

[14]宋琳琳.五倍子中抗蕃茄晚疫病菌有效成分的提取分离及抑菌效果的研究[D].吉林：吉林农业大学硕士论文，2013.

[15]王钦德，杨坚.食品试验设计与统计分析[M].第二版.北京：中国农业大学出版社，2010.

[16]韩雯雯.番泻叶抑菌成分的提取分离与抑菌作用研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学硕士论文，2012.

[17]周邦靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法[M].重庆：科学技术出版社重庆分社，1987.

2015中国调味品展招商启动

2015年11月23-25日，由中国调味品协会主办的2015中国（国际）调味品及食品配料博览会将在上海光大会展中心召开，目前相关的展会招商工作已经全面启动。

本届展会将继续保留以往的特色专区，如机械设备专区、国际企业专区、中华老字号专区、火锅调味料专区、酱腌菜专区、腐乳专区、名优食醋专区和地方政府专区。此外，今年还将增设包装材料、包装设计专区和检测设备专区。预计展览面积将超15 000 m2，参展企业将超过400家。

展会同期，2015年中国调味品产业营销高峰论坛、全国调味品经销商（上海）发展论坛、第六届中国调味品新配料技术论坛、2015调味品行业科技论坛、第三届中国火锅文化节、全国烹饪大赛及名厨表演活动等多个营销论坛、技术论坛以及主题文化推广活动将继续开展。此外，2015年正值中国调味品协会成立20周年，CFE2015同期将举办盛大的庆典活动，届时协会将对调味品行业二十年发展历程作一个回顾和总结，对调味品行业未来发展的方向作前瞻性探讨。

摘自中国调品味协会信息

Optimization of extraction conditions of anti-tomato-late-blight components from Scutellaria baicalensis

LI Xiaojuan1,LI Zhengying2*
(1.College of Food Science and Engineering,Inner M ongo lia Agricultural University,Hohhot 010000,China; 2.College of Vocational Technical Institute,Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109,China)

Constant temperature water bath extraction was used to extract baicalin from Scutellaria baicalin with anhydrous ethanol.The effects of extracting time,extraction temperature,solid-liquid ratio and extraction times on antibacterial effect of tomato late blight from radix S.bacteriostatic was discussed.The optimal extraction process was determined by orthogonal experiment and the minimum bacteriostasis concentration was determined.The results showed the optimum conditions were as follow s:extraction temperature 65℃,extracting time 1.0 h,solid-liquid ratio 1∶45(g∶m l), extraction times 2.Under this condition,the inhibitory zone diameter was 34.3 mm.The minimum inhibitory concentration(MIC)was 15.7 mg/m l.

Scutellaria baicalensis;tomato late blight;extraction technology;M IC

TS201.1

A

0254-5071（2015）03-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.025

2015-01-08

李晓娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。

*通讯作者：李正英（1964-），男，教授，博士，研究方向为农产品加工及贮藏。