同位素示踪技术定量分析肿瘤细胞中的代谢重编

林树海 ， 蔡宗苇

（香港浸会大学化学系，环境与生物分析国家重点实验室，香港999077）

对于分化了的细胞而言，在氧气充足情况下，可通过糖酵解进入三羧酸循环，实现葡萄糖的完全氧化，产生大量三磷酸腺苷（ATP）。只有在氧气不足的时候，才依赖于糖酵解通路产能，并产生大量的乳酸。但肿瘤细胞显然不同。肿瘤是一种异质性疾病，是细胞在失控条件下疯狂生长，从而影响人体健康的一类恶性疾病。肿瘤细胞与正常细胞的代谢差异早在20 世纪20 年代就引起德国科学家奥托-瓦伯格（Otto Warburg）的注意。他通过物理化学方法，检测了肿瘤组织与正常组织在泌酸与耗氧方面的差异，总结出瓦伯格效应（Warburg effect）［1，2］。该效应提出如下假说：肿瘤细胞主要依赖于糖酵解通路获得能量，不管氧气是否存在及氧含量多少，都产生过量的乳酸（如图1 所示）。虽然糖酵解通路是一条效率低下的产能通路，这种能量供应方式也被称为需氧糖酵解。这项假说提出以后，有长达数十年被人们所遗忘，直到20 世纪90 年代才开始有人重新研究瓦伯格效应。对瓦伯格效应的理解也逐步深入，并从糖代谢衍生到其他代谢，比如谷氨酰胺代谢、脂代谢等［3，4］。

1 碳-13 标记的示踪分析

图1 氧气（a）充足和（b）不足时的糖酵解［3］Fig.1 Glycolysis under （a）high and （b）limited oxygen conditions［3］

为了更好地理解肿瘤代谢的变化规律，我们需要一种新的检测方法。同位素标记的示踪分析方法就是让癌细胞摄取含有同位素标记的营养物质，如葡萄糖、谷氨酰胺等，然后检测其他中间代谢产物的同位素标记情况，反映出癌细胞中的代谢调控［5］。在细胞培养中，可以先用全碳-13 标记的葡萄糖与没有同位素标记（碳-12）的谷氨酰胺混合，共同在细胞培养基中培养细胞一段时间（比如24 h），然后收集细胞并提取代谢物做代谢流分析（如图2 中所示的红色标记的碳-13）。另一种情况就是采用全碳-13 标记的谷氨酰胺与没有同位素标记（碳-12）的葡萄糖混合，共同在细胞培养基中培养细胞一段时间，所得细胞代谢物用于代谢流分析（如图2 中所示的蓝色标记的碳-13）。利用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱可以提高分析的灵敏度与选择性。在不同的代谢反应中，同一代谢物因含不同数目的碳-13 标记，母离子与子离子质荷比也不同。经优化质谱参数后定量分析，可判别细胞中的代谢切换。例如，含有4 个碳-13 的苹果酸可来源于谷氨酰胺氧化代谢通路，而含3 个碳-13 的苹果酸则可来源于谷氨酰胺还原代谢通路。现以著名的癌基因Kras 为例来讨论糖代谢与谷氨酰胺代谢。Kras 是一个重要基因，在肿瘤细胞生长、增殖以及血管生成等过程的信号传导通路中起着“开关”作用，从而影响肿瘤的生长和扩散。Ying 等［6］采用碳-13 标记的葡萄糖培养癌基因Kras 高表达的癌细胞，然后通过质谱检测含有碳-13 的中间代谢物，包括糖酵解通路与三羧酸循环。这种同位素标记示踪分析技术可判别代谢的速率和方向的改变。后来又进一步采用碳-13 标记的谷氨酰胺培养癌细胞，也同样检测碳-13 标记的代谢物［7］。有趣的是，从谷氨酰胺进入三羧酸循环有两条通路，一条是氧化代谢途径，另一条是还原反应代谢途径。如图2 所示，质谱技术检测到的三羧酸循环代谢产物，其碳源可能有3 条途径；一条是糖酵解；一条是在线粒体中进行的谷氨酰胺氧化代谢；另一条则是在胞浆中进行的谷氨酰胺还原代谢。基于质谱的同位素示踪技术体现出独特的优势，可定量分析细胞代谢的动态变化。这一分析技术越来越得到重视和广泛应用。再如新近《分子细胞》杂志报道的美国德州西南医学中心DeBerardinis 博士课题组［8］的工作，他们发现在肿瘤细胞中，当线粒体的丙酮酸运载体失活的时候，谷氨酰胺的氧化代谢即可保持三羧酸循环运转并维持细胞存活。线粒体的丙酮酸运载体是从葡萄糖进入三羧酸循环中的一个关键蛋白。这个关键蛋白的活性一旦异常，会影响到葡萄糖代谢。但令人惊讶的是，谷氨酰胺代谢即可起到替代作用。从图2 中还可以看到，谷氨酰胺进入细胞，代谢成谷氨酸，进而脱氨生成α-酮戊二酸。DeBerardinis 课题组［9］还报道了在线粒体缺失的肿瘤细胞中，谷氨酰胺还原代谢同样是需要的，并且这种还原代谢与α-酮戊二酸的氧化代谢同等重要，也就是说肿瘤细胞中可利用三羧酸循环的双重代谢来实现快速增殖所需要的能量需求。这从本质上讲，谷氨酰胺代谢早已超出瓦伯格效应的研究范畴，打破了过去一直认为的肿瘤细胞的线粒体不活跃的说法。

除了葡萄糖、谷氨酰胺之外，代谢组学结合同位素标记的示踪分析可鉴定其他重要的代谢物。2012年《科学》杂志就报道了代谢组学与碳-13 标记的示踪技术鉴定出甘氨酸在60 种肿瘤细胞株中对促进细胞生长起到重要作用［10］。今年5 月《细胞报道》［11］和9 月的《癌发现》［12］又分别提出另一代谢物丝氨酸可能比甘氨酸更重要，特别是进入一碳代谢后更容易促进细胞增殖与生长。由此可见，同位素标记示踪技术这一分析化学方法在判别肿瘤细胞的代谢变化规律时有独特的优势。

2 氘代标记的示踪分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）中与腺嘌呤相连的核糖环系2′-位的磷酸化衍生物，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。这些反应中需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为还原剂、氢负供体，NADPH 是NADP＋的还原形式。NADPH 对细胞生长与增殖、抗氧化都具有重要意义［13］。中国科学技术大学生命科学学院吴缅教授与美国宾夕法尼亚大学医学院杨小鲁教授合作，在癌症代谢机制研究中取得一项新的突破性发现，即证实p73 蛋白激活了癌细胞中的磷酸戊糖途径，支持了肿瘤细胞的增殖［14］。吴缅和杨小鲁课题组经过多年合作研究发现，p73 是通过一条葡萄糖代谢旁路即磷酸戊糖途径，在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用。他们通过实验证明，高表达的p73 使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）这一关键酶的活性大大增强，从而激活了在正常细胞中较少被使用的代谢旁路，即磷酸戊糖途径，细胞中大量的葡萄糖通过这一旁路被消耗。这一代谢途径无法产生细胞生长必需的能量，而是产生大量戊糖与强还原剂NAPDH，前者用于合成核苷酸，后者则会参与脂肪酸合成和清除一种对肿瘤细胞有抑制作用的氧化物，即活性氧自由基（reactive oxygen species：ROS），从而满足肿瘤细胞无限、旺盛的生长。

图2 全碳-13 标记的葡萄糖与未标记谷氨酰胺培养的癌细胞，以及未标记葡萄糖与全碳-13 标记的谷氨酰胺培养的癌细胞的代谢通路Fig.2 Metabolic pathways in cancer cells fed with［U-13 C6］-glucose and unlabeled glutamine or unlabeled glucose and［U-13C5］-glutamine

为了分析检测代谢底物转化为NADPH 的动态变化，今年6 月和7 月的《自然》［15］与《分子细胞》［16］分别报道了基于质谱的氘代示踪技术定量分析细胞中不同代谢通路产生NADPH 的差异与动态规律。目前普遍认为哺乳细胞中有约60%的NADPH 来自磷酸戊糖途径，但新的研究表明，在某些肿瘤细胞中，磷酸戊糖途径与苹果酸酶约各贡献30%的NADPH，而一碳代谢却产生约40%的NADPH。这意味着一碳代谢可能更重要。为了进一步在细胞中定位（区域化），可采用氘代的方法标记营养物并用于细胞培养中。丝氨酸与甘氨酸作为一碳代谢的前体代谢物，可经由一碳代谢产生NADPH。在细胞培养中，Lewis 等［16］用［2，3，3-2H3］标记的丝氨酸追踪检测［2H］-NADPH，发现丝氨酸转化为甘氨酸这一过程在线粒体中的丝氨酸羟甲基转移酶2 催化下产生NADPH（见图3a）；另外，用类似的办法，用［2，2-2H2］标记甘氨酸发现甘氨酸可以通过甘氨酸脱羧酶催化产生NADPH（见图3b）。

图3 线粒体中的一碳代谢［16］Fig.3 One-carbon metabolism in mitochondria［16］

3 前景展望

稳定同位素标记稀释技术很早就被用作内标，但细胞摄取同位素标记的营养物，根据生物化学反应规律探寻该同位素的转归则是分析化学与生物化学相结合产生的一门新兴技术方法。目前采用最多的是碳-13 标记，用于分析细胞代谢物的碳源差异。本文重点讨论的是碳-13 标记与氘代标记的示踪分析技术用于定量分析细胞代谢中不同通路的差异。其中氘代示踪分析技术改变了生物化学中传统的观点，即NADPH 约60%来源于磷酸戊糖途径。实际上可能没那么多来自磷酸戊糖途径，至少在肿瘤细胞中如此。一碳代谢的重要性必须得到重视，其对肿瘤细胞而言可能更为重要。未来的研究可能还将采用氮-15 标记分析氨基酸和核苷的合成规律，对深入理解细胞中的生物化学反应提供重要证据。这也是代谢组学，特别是代谢流分析技术带来的优势。

［1］ Warburg O，Wind F，Negelein E. J Gen Physiol，1927，8（6）：519

［2］ Warburg O. Science，1956，123（3191）：309

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［9］ Mullen A R，Hu Z，Shi X，et al. Cell Rep，2014，7（5）：1679

［10］ Jain M，Nilsson R，Sharma S，et al. Science，2012，336（6084）：1040

［11］ Labuschagne C F，van den Broek N J，Mackay G M，et al.Cell Rep，2014，7（4）：1248

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［15］ Fan J，Ye J，Kamphorst J J，et al. Nature，2014，510（7504）：298

［16］ Lewis C A，Parker S J，Fiske B P，et al. Mol Cell，2014，55（2）：253