在线固相萃取／液相色谱-线性离子阱质谱法同时定性定量检测全血和尿液中7 种抗凝血杀鼠药

黄克建 ， 卢敏萍， 周 哲， 林翠梧， 杨 宁， 刘晓锋， 朱定姬，梁 平， 乔文涛， 李宏森， 李 璐， 黄晓青

（1. 广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心，广西 南宁530012；2. 广西大学化学化工学院，广西 南宁530004；3. 赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海201206；4. 广西壮族自治区职业病防治研究院，广西 南宁530021）

抗凝血杀鼠药是目前广泛使用的一类慢性杀鼠药，由4-羟基香豆素或茚二酮母体结构衍生而来［1］。抗凝血杀鼠药进入机体后，会拮抗维生素K1的活性，抑制肝脏产生凝血酶原及凝血因子，使凝血酶失去活性，同时提高毛细血管通透性和脆性，因而造成各脏器及黏膜大面积出血而死亡［2］。与急性杀鼠药如毒鼠强相比，该类慢性杀鼠药由于具有广谱、高效、适口性好、毒性相对较低、不易引起二次中毒且有特效解毒药维生素K1 等特点，广泛应用于室内和野外杀鼠工作［3］。由于这类药物比较容易获得，近年来人、家畜、野生动物等中毒情况时有发生。目前，检测生物样品中抗凝血杀鼠药已成为公安机关刑事技术部门日常主要任务之一。因此，建立一种快速检测血液和尿液中抗凝血杀鼠药的方法，可为中毒者对症治疗、公安机关立案侦破及诉讼提供科学依据。

目前，抗凝血杀鼠药的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）［3，4］、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）［5］和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS／MS）［6-16］。TLC 和UV-Vis 检测灵敏度低，难以满足检测要求；GC 和GC-MS 前处理耗时长，衍生化过程复杂，且抗凝血杀鼠药通常相对分子质量较大，部分甚至含有羟基，不易气化，不宜用GC 和GC-MS 分析；HPLC 可以准确检测μg／mL、μg／g 级的样品，但以色谱保留时间作为唯一定性指标缺乏足够的选择性，可能会导致假阳性结果［1］。而LC-MS／MS 则结合了色谱分离与质谱结构确证的优势，样品前处理无须衍生化，可选择多级离子扫描检测，能同时进行多组分的定性确证和定量分析，具有灵敏度高、检出限低的优点，因此广泛应用于抗凝血杀鼠药的检测中。由于尿液、血样、组织等生物样品的基质成分复杂，蛋白质等基质成分严重影响定性和定量结果；且样品中的盐不但会干扰质谱分析的离子化过程，还会污染离子源，使灵敏度大大降低［17］。因此，在应用LC-MS／MS 进行定性与定量分析时，一般需要进行样品前处理，这是极为重要的环节，也常是最耗时、最困难的工作［18］。现有的抗凝血杀鼠药样品前处理方法通常采用蛋白质沉淀法［3］、液液萃取法［4，5，8-13］和离线固相萃取法（offline SPE）［6，7，14-16］等。这些方法均可起到富集、减少基质干扰的作用，但存在操作繁琐、步骤多、耗材成本高、重现性差、低通量等问题。与传统的液液萃取、离线固相萃取相比，近年发展起来的在线固相萃取（on-line SPE）技术显著简化了样品前处理工作，因具有自动化程度高、富集效果好、样品损耗低、SPE 柱可重复使用等优点，近年来在药物分析、食品安全、环境科学等诸多领域得到广泛的应用［18-20］。目前，尚未见关于抗凝血杀鼠药的在线固相萃取前处理方法的报道。

本研究建立了在线固相萃取／液相色谱-线性离子阱质谱（on-line SPE／LC-LIT／MS）快速检测血液、尿液中克灭鼠、杀鼠灵、杀鼠醚、敌鼠、氯敌鼠、溴敌隆和大隆7 种抗凝血杀鼠药的分析方法，为中毒案（事）件的抗凝血杀鼠药的快速筛查提供科学依据和技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DionexTMUltimate 3000TM双三元液相色谱系统（美国赛默飞世尔科技有限公司），配备DGP-3600SD 脱气机、TCC-3000SD 柱温箱（带六通阀）、WPS-3000TFC-ANALYTICAL 自动进样器、MWD-3000 紫外检测器。质谱系统：LTQ XLTM型线性离子阱质谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），配加热电喷雾离子源（HESI-II）、XcaliburTM数据处理系统、Mass Frontier 7.0TM软件。3-18R 高速冷冻离心机（美国TOMOS 公司）；SB 3200-HT 超声波清洗器（必能信上海有限公司）；Master-s UV 超纯水发生器（上海和泰仪器有限公司）。

克灭鼠（coumafuryl，纯度99.0%）、杀鼠醚（coumatetralyl，纯度99.9%）、杀鼠灵（warfarin，纯度97.2%）、敌鼠（diphacinone，纯度98.0%）、氯敌鼠（chlorophacinone，纯度98.9%）、溴敌隆（bromoadiolone，纯度93.6%）和大隆（brodifacoum，纯度99.3%）标准品购自美国Sigma 公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵为色谱纯（美国Fisher 公司）；实验用水为超纯水。

分别准确称取7 种标准品，用乙腈溶解定容，配制成200 μg／mL 的单标准储备液，于-15 ℃下保存。使用时根据需要用乙腈稀释，配制成不同质量浓度的单标准工作液和混合标准工作液。

1.2 在线固相萃取和色谱条件

在线SPE 柱：Waters Oasis®HLB（20 mm×3.9 mm，15 μm）。左泵为在线固相萃取泵，流动相A：水；流动相B：甲醇。分析柱：Dionex AcclaimTMRSLC 120 C18（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。右泵为分析泵，流动相A：0.02 mol／L 乙酸铵溶液；流动相B：甲醇。柱温40 ℃；进样量50 μL；梯度洗脱条件及六通阀切换程序见表1，on-line SPE／HPLCMS 流路图见图1。

表1 梯度洗脱条件及六通阀切换程序Table 1 Gradient elution and valve switching programs

图1 在线固相萃取／液相色谱-线性离子阱质谱的流路图Fig.1 Diagram of on-line SPE／HPLC-MS

1.3 质谱条件

电离方式为ESI 负离子模式；喷雾电压为4 000 V；棱镜电压为85 V；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气35 arb；辅助气15 arb；氦气用作碰撞气；离子源温度为300 ℃；毛细管温度为350 ℃；隔离窗口为2 amu；采用保留时间锁定目标化合物二级子离子全扫描方式，分别记录7 种抗凝血杀鼠药的二级子离子数据。保留时间锁定窗口见图2，主要质谱参数见表2。

1.4 样品处理

吸取0.5 mL 全血和尿液，分别置于10 mL 试管中，再分别加入1 mL 乙腈，然后涡旋振荡1 min，随后分别加入3.5 mL 乙酸铵水溶液（0.02 mol／L），超声提取5 min 后在10 000 r／min 的转速下离心5 min，上清液过0.22 μm 滤膜，供LC-MS分析。

表2 7 种抗凝血杀鼠药的主要质谱参数Table 2 Main MS parameters of the seven anticoagulant rodenticides

图2 7 种抗凝血杀鼠药同时分析时的采集时间窗口Fig.2 Data acquisition time window for simultaneous analysis of the seven anticoagulant rodenticides

2 结果与讨论

2.1 在线SPE 条件的优化

选用合适的在线SPE 柱和设计合理的富集净化和洗脱条件，是在线SPE 方法的关键［19］。本方法选用Waters Oasis®HLB 柱作为在线SPE 柱，该柱为反相保留机理，对酸性、中性和碱性化合物均具有吸附作用，富集效果好，是一种通用型萃取柱。考察了阀切换时间对萃取的影响，用SPE 柱代替分析柱直接与质谱检测器连接，以水为流动相，结果样品中基质流出SPE 柱所需的时间为3 min，阀切换时间应晚于该时间，因此选择在4 min 时将阀由1_2切换至6_1 状态，既有效除去基质干扰，又保证了目标分析物有较高的萃取效率。

另外考察了分析柱流动相中有机相的初始比例对目标物洗脱和分离的影响。有机相初始比例高，可以将目标物快速转移至分析柱，但目标物在短时间内集中流出，不利于分离。实验最终选择40% 的有机相初始比例，既可以有效避免色谱峰展宽问题，提高响应值，又可以使7 种杀鼠药得到较好的分离。

2.2 分析柱的选择

抗凝血杀鼠药主要包括茚满二酮类和4-羟基香豆素类两种，其中敌鼠、氯敌鼠属于前者，含有多个羰基构成的酰亚胺结构；溴敌隆、溴鼠灵、克鼠灵、杀鼠醚和杀鼠灵属于后者，含有α，β-不饱和羰基及羟基，因此这7 种杀鼠药均为弱酸性化合物，并有一定的极性。

考察了Hypersil GOLD C8、Hypersil GOLD C18 和AcclaimTMRSLC 120 C18 型分析柱对7 种杀鼠药的保留作用，通过分析比较峰形、分离效果和响应值，最终选择AcclaimTMRSLC 120 C18 作为分析柱，7 种杀鼠药的提取离子色谱图见图3。

图3 7 种杀鼠药的提取离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatograms of the seven anticoagulant rodenticides

2.3 流动相的选择

样品中分析物的保留行为是分析物与固定相、流动相相互作用的结果，因此流动相选择适当与否对分析物的分离尤其重要。对乙腈-乙酸铵水溶液和甲醇-乙酸铵水溶液两种体系进行了考察，在相同条件下，采用甲醇-乙酸铵水溶液为分析流动相时，7种杀鼠药的响应值明显更高。以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相，考察了甲酸对检测结果的影响。结果发现，流动相中甲酸体积分数为0.05% ～0.1% 时，7种杀鼠药的峰形较宽，且均出现了不同强度的［MH＋68］-峰，推测为目标物与甲酸钠（HCOONa）结合形成的，其中敌鼠和氯敌鼠最为明显，不但拖尾严重，还出现了较强的［M-H＋68］-峰；而流动相不含甲酸时，7 种杀鼠药色谱峰形对称，［M-H＋68］-峰消失，且敌鼠和氯敌鼠的［M-H］-响应值比含甲酸情况下提高了10 倍以上。可能原因是7 种杀鼠药均为弱酸性化合物，其在酸性流动相中形成分子态，不利于色谱分离和质谱检测，当流动相不加甲酸时，pH 高于分析物的pKa2 个单位以上，有利于色谱分离和提高分析物的离子化效率，7 种杀鼠药的pKa值见表3。根据实验结果，最终选择甲醇和0.02 mol／L 乙酸铵水溶液为流动相。

表3 7 种抗凝血杀鼠药的pKa 值Table 3 pKa values of the seven anticoagulant rodenticides

2.4 基质溶液酸碱性对萃取效率的影响

比较了基质溶液pH 值分别为4.8、7.0 和9.2时7 种抗凝血杀鼠药的萃取效果。结果表明，在不同pH 值下均能萃取到7 种抗凝血杀鼠药，总体来说酸性和中性条件下萃取效果比较好，碱性条件下虽然也能获得较好的萃取效果，但重现性较差。结合流动相考虑，最终选取0.02 mol／L 乙酸铵水溶液（pH 7.0）为样品的稀释液。基质酸碱性对萃取效率的影响见图4。

2.5 乙腈加入量对萃取效率的影响

图4 基质溶液pH 对萃取效率的影响Fig.4 Influence of pH value of matrix solution on extraction efficiency

血液和尿液样品用SPE 处理时，常需加入有机溶剂来沉淀蛋白质，以降低堵塞SPE 柱的风险。选取乙腈为蛋白沉淀剂，考察了基质溶液中乙腈的体积分数对萃取效率的影响。结果如图5 所示，基质溶液中乙腈的体积分数为5% ～45% 时均能萃取到药物，综合考虑后选择添加20% 乙腈。

图5 乙腈含量对萃取效率的影响Fig.5 Influence of volume percentage of acetonitrile on extraction efficiency

2.6 定量离子的选择

本研究采用从二级全扫描信号中提取子离子进行定量的方式，故二级离子的选择对定量结果有重要的影响。对碎裂机理进行研究，选择高灵敏度和高专属性的碎片作为定量离子。香豆素类抗凝血杀鼠药一个较为常见的碎片为香豆素基团形成的m／z 161 碎片，该碎片是克灭鼠和杀鼠灵的优势碎片，故选择m／z 161 为两者的定量离子；杀鼠醚、大隆的优势碎片都是脱去O-C＝O 基团、中性丢失44 后形成的碎片离子，故分别选择m／z 247 和m／z 477 为两者的定量离子；溴敌隆因存在独立羟基，优势碎片是由脱O-C＝O 和脱H2O 共同形成的m／z 463，选择其作为定量离子。茚二酮基团形成的m／z 145 离子是茚二酮类抗凝血杀鼠药形成的主要碎片之一，在敌鼠和氯敌鼠的二级质谱图中均可观察到响应较高的m／z 145 峰，但这两个化合物的优势碎片是乙酰基断裂后由二苯基基团形成的离子，这可能与二苯基可以更好地共轭电子有关，故分别选择m／z 167 和m／z 201 为两者的定量离子。各药物的二级质谱图及裂解方式见图6。

图6 7 种抗凝血杀鼠药的二级质谱图及裂解方式Fig.6 MS2and fragmentation patterns of the seven anticoagulant rodenticides

2.7 自建数据库定性确证

在Mass Frontier 7.0 的Database Manager 中建立7 种抗凝血杀鼠药的液相色谱-线性离子阱质谱数据库，库中包括化合物名称、分子式、相对分子质量、CAS 登录号、结构式、二级质谱图和保留时间等信息。进行定性检索时采用联合组分检测（Joint Components Detection）算法，对样品数据中的组分进行查找。基于所有离子轮廓图最大值的统计分析，通过提取各个质谱峰丰度轮廓图，可创建出样品中化合物的纯净质谱树，生成相应的峰形，并自动与库中化合物的母离子、碎片离子和保留时间等信息匹配。在没有标准品的情况下，也能够通过本方法实现对样品的快速准确定性筛查。该数据库为开放体系，可在后续工作过程中不断增加目标化合物至数据库中，为应用的进一步拓展提供了前景。

2.8 方法的线性范围和检出限

在空白血液和尿液中添加7 种抗凝血杀鼠药的混合标准工作溶液，得到0.10 ～1 000 ng／mL 系列样品，按1.4 节方法进行处理。以目标分析物的质量浓度C（ng／mL）为横坐标，峰面积A 为纵坐标，绘制7 种杀鼠药的标准工作曲线。采用逐步稀释法进行测试，以信噪比（S／N）≥3 确定检出限（LOD），以S／N≥10 确定定量限（LOQ）。7 种杀鼠药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限等结果见表4。

表4 7 种抗凝血杀鼠药的线性范围、线性方程、相关系数（r2）、检出限和定量限Table 4 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r2），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the seven anticoagulant rodenticides

2.9 方法的加标回收率及精密度

在空白血液和尿液中分别添加不同量的混合标准溶液，配制成低、中、高3 个浓度水平的加标溶液，按1.4 节方法进行处理，每个浓度水平均平行测定6 次，考察方法的精密度和回收率（见表5）。

表5 全血和尿液中7 种抗凝血杀鼠药的加标回收率和精密度（n＝6）Table 5 Recoveries and precisions of the seven anticoagulant rodenticides in whole blood and urine samples （n＝6）

3 结论

建立了快速测定血液、尿液中7 种抗凝血杀鼠药的在线固相萃取／液相色谱-线性离子阱质谱检测方法。样品经乙腈沉淀蛋白质，稀释、离心和过滤后即可直接进样，与传统的离线SPE 相比较，在线SPE 具有速度快、成本低、能自动化分析等优点，克服了使用离线SPE 带来的成本高、费时费力等缺点，大大提高了检测通量。相较于传统三维离子阱，二维线性离子阱内的离子沿线性方向聚集，有效降低了空间电荷效应，大大提升了阱内离子容量，具备同时定性定量的能力；利用线性离子阱的这种性能，采用二级全扫描确证和子离子定量的方法，一针进样即可实现同时定性定量分析。该方法操作简便快速、结果准确、重现性好、灵敏度高，非常适合血液、尿液样品中抗凝血杀鼠药的筛查与确证。

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