诱捕受体3在胆囊癌中的表达及临床意义

柴友龙，张 晖，孔 棣，罗彦英

论著

诱捕受体3在胆囊癌中的表达及临床意义

柴友龙1，张 晖1，孔 棣1，罗彦英2

目的：探讨诱捕受体3（DcR3）蛋白在胆囊癌组织中的表达。方法：采用免疫组织化学SP法检测DcR3蛋白在胆囊癌组织、胆囊管状腺瘤组织、胆囊腺肌瘤病组织及慢性胆囊炎组织中的表达，藉此评价其与多种临床特征之间的关系。结果：胆囊癌组织中DcR3阳性表达率为68.4%（26/38），胆囊管状腺瘤、胆囊腺肌瘤病及慢性胆囊炎组织的DcR3阳性表达率分别为10%（2/20）、18.6%（3/16）及5.6%（2/26）。DcR3的表达水平均与胆囊癌的淋巴转移及TNM分期有关(均P＜0.01)。结论：DcR3在胆囊癌组织中具有较高的表达率，特别在有淋巴结转移及临床病理分期的癌组织中表达增高，DcR3的过度表达在胆囊癌的发生、发展过程中起着重要作用。

胆囊癌；诱捕受体3；免疫组织化学

诱捕受体3（decoy receptor 3，DcR3）又称肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR) 6B，是最近发现的TNFR超家族成员之一。DcR3作为肿瘤坏死因子超家族成员，已证实有抗凋亡、调控免疫应答和抑制炎症反应等效应。国内外许多研究表明，DcR3在多种肿瘤组织中高度表达。本文探讨DcR3蛋白在胆囊癌组织中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集天津市南开医院2006年1月—2009年1月住院患者手术标本的存档蜡块，均为手术切除胆囊标本，所有标本均经术后病理检查确诊且临床资料完整。所有患者术前均未做放疗、化疗及其他针对肿瘤的治疗，也无服用非甾体类药物病史。38例胆囊癌基本资料详见表1。另收集胆囊腺肌瘤病标本16例，胆囊管状腺瘤标本20例，慢性胆囊炎标本26例。

1.2 免疫组织化学方法 免疫组织化学SP法检测DcR3在胆囊癌、胆囊腺肌瘤病、慢性胆囊炎及胆囊管状腺瘤组织中的表达。免疫抗人单克隆抗体购于Bioworld公司。5μm切片常规脱蜡脱水，3%H2O2处理10min，高温高压EDTA修复30min，胃蛋白酶在37℃温箱中修复20min，正常山羊血清封闭10min，滴加一抗4℃过夜。滴加生物素标记的二抗，室温孵育15min，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温孵育15min。各步骤之间以PBS冲洗5min，连续3次。以PBS溶液代替一抗做阴性对照。采用DAB显色，苏木精复染核，中性树胶封固。

表1 38例胆囊癌患者基本资料

1.3 免疫组织化学结果判定 DcR3蛋白免疫组化阳性表达主要定位在细胞质，呈淡黄色至深棕色均质颗粒。阳性结果判定参考许良中[1]的方法，将所有细胞质着色的指标染色结果进行半定量记分，即每片切片肿瘤组织中阳性细胞着色强度与阳性细胞比例分别记做1分、2分、3分，根据两项积分的乘积判断其阳性程度。肿瘤细胞无染色为0分，染色成淡黄色颗粒为1分，黄色颗粒为2分，棕褐色颗粒为3分。阳性细胞比例全部阴性为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，≥51%为3分。两项评分值的乘积0～2分为（-），3～4分为弱阳性（+），5～7分为阳性（++），8～9分为强阳性（+++）。

1.4 统计学处理 应用统计学处理用SPSS10.0软件包，采用χ2检验、秩和检验及精确概率法对相应资料进行分析，以P＜0.05为有显著性意义。

2 结果

DcR3在胆囊癌组织中的表达与其在胆囊腺肌瘤病、胆囊管状腺瘤及慢性胆囊炎中的表达有明显差异（P＜0.01），炎症组织与管状腺瘤组织、腺肌瘤病组织比较无统计学差异，见表2。在胆囊癌组织中DcR3的表达与性别、年龄及组织学分级关系不大，但与淋巴结转移及TNM分级有关，越晚期的癌组织DcR3表达阳性率越高，详见表3。DcR3在癌组织的阳性定位见图1示。

表2 DcR3在胆囊癌、胆囊腺瘤、胆囊腺肌瘤病及慢性胆囊炎组织中的表达

表3 DcR3在不同临床病理特征的胆囊癌组织中的表达情况

3 讨论

胆囊癌是胆道系统常见的高度恶性肿瘤，占消化道肿瘤第5～6位[2]，男女发病率之比为1∶4。因其恶性程度高，起病隐匿，缺乏特异性的临床表现，早期诊断较困难，患者就诊多属中晚期，预后较差，术后5年生存率不足5%[3]。提高原发性胆囊癌的早期诊断水平，为早期治疗创造条件，一直是人们所关注的问题。随着分子生物学的发展，已知肿瘤是基因水平异常表达引起的，其发生、发展、转移及预后转归均与癌基因和抑癌基因的突变相关。本研究采用免疫组化法检测DcR3在胆囊癌、胆囊管状腺瘤、胆囊腺肌瘤病及慢性胆囊炎组织中的表达，比较DcR3在胆囊癌组织中的表达与其在慢性胆囊炎、胆囊管状腺瘤及胆囊腺肌瘤病组织中的表达关系，明确DcR3与胆囊癌年龄、性别、组织分级、肿瘤浸润及淋巴结转移等相关性。

图1 DcR3在胆囊癌中的阳性表达（HE×20）

1998年，Pitti等[4]在搜索表达序列标签数据库时，发现并命名为DcR3。DcR3具有抑制凋亡和促进肿瘤细胞免疫逃避的双重功能，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一，它通过3条途径来抑制细胞凋亡。DcR3mRNA在正常人体组织的胃、脊髓、淋巴结、肺、脾、结肠及多数造血细胞中有低水平表达，但在胃肠道肿瘤的阳性率及阳性强度均明显增加，阳性率为44%。是TNFR家族的新成员，具有抑制凋亡和促进肿瘤细胞免疫逃避的双重功能。人类恶性肿瘤显示DcR3基因，无论在基因水平还是在蛋白水平均出现过度表达，而且这种过度表达仅仅出现在肿瘤组织中，临近的正常组织则不表达或偶尔低表达。Bai等[5]采取Northern印迹法，对食管肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤与正常对照进行比较分析,结果肿瘤细胞DcR3mRNA高度表达,有的甚至高达20倍。Tsuji等[6]利用RT-PCR对胰腺癌细胞株和组织分析后，发现DcR3mRNA在胰腺癌细胞株和组织中都存在高表达，并且跟肿瘤对静脉的侵袭性呈正相关。陈罡等[7]用RT-PCR技术从5种肝癌细胞系中均克隆获得了DcR3基因,并证实有DcR3蛋白的表达,而且DcR3在5种肝癌细胞系中均存在mRNA和蛋白的过表达,癌旁肝细胞系与正常肝细胞系则均无表达。段伟宏等[8]在DcR3反义RNA与顺铂对肝癌细胞凋亡影响的比较中证明显示DcR3反义RNA与肿瘤细胞内的RNA链形成互补的二倍体从而导致DcR3翻译程序终止,DcR3的分泌量下降促进肿瘤细胞凋亡作用。王鲁平等[9]用免疫组化ABC法检测29例乳腺癌组织、20例转移淋巴结及4例乳腺良性病变中的DcR3基因表达，良性乳腺病变中无表达，DcR3在乳腺癌中表达增高，伴有淋巴结转移的乳腺癌DcR3表达率有明显增高倾向。本实验选取了38例胆囊癌组织、20例胆囊管状腺瘤组织、16例胆囊腺肌瘤病组织及26例慢性胆囊炎组织，通过免疫组织化学SP法检测了其中的表达情况。结果显示，在胆囊癌组织表达阳性率为68.4%，明显较胆囊管状腺瘤组织、胆囊腺肌瘤病组织及慢性胆囊炎组织高，其差异具极显著统计学意义。

国内外研究表明，DcR3在肿瘤组织的表达与临床病理分型有着密切的关系。在本次研究的38例胆囊癌组织中，DcR3的表达在胆囊癌的年龄、性别及组织学分型分组中差异无显著性（P＞0.05)，胆囊癌组织中DcR3在TNM分期中，晚期胆囊癌DcR3阳性表达明显与肿瘤早期表达有显著差异（P＜0.01)。提示DcR3的表达与胆囊癌的临床病理学分期密切相关，对指导临床工作有一定的参考价值。同时，DcR3在肿瘤侵润及淋巴转移方面，DcR3蛋白的阳性表达有明显统计学意义（P＜0.05)。目前研究认为，DcR3基因扩增和高表达是导致肿瘤发生的重要机制之一。由于DcR3是分泌蛋白，检测血清DcR3含量具有可行性，血清DcR3可作为恶性肿瘤临床诊断、治疗和监测预后的可靠指标。Shen等[10]对48例病理学诊断的原发性肝癌组织进行分析，DcR3 mRNA的表达与肿瘤的大小、临床分期、肿瘤的浸润及转移有关。胡连贺等[11]证明喉癌组织中DcR3蛋白的表达量及阳性表达率均明显高于癌旁组织及正常喉黏膜组织。李平等[12]采用免疫组化SP法检测胃癌组织和癌旁正常胃组织中DcR3的表达，DcR3的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位及浸润深度等临床因素无相关性，同时证明，DcR3在胃癌组织中具有较高的表达率,其表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，DcR3高表达提示预后不良。王劲欧等[13]采用免疫组织化学SP法检测106例卵巢上皮性肿瘤中DcR3的表达，DcR3的阳性率与患者年龄无相关性，与FIGO临床分期及组织分化水平亦存在着显著性相关。周健等[14]通过免疫组织化学和ELISA分别检测组织和血清中DcR3蛋白的表达，结果发现胰腺癌患者胰腺癌组织和血清中DcR3蛋白高表达。胜利等[15]研究发现，结肠癌患者与健康志愿者的外周血中DcR3基因mRNA表达水平有着明显差异，说明DcR3基因异常表达与结肠癌有一定的关系。因此，血清及组织中的DcR3水平在临床上对肿瘤早期诊断，手术的淋巴结清扫范围的指导及手术切除效果评价，在化学治疗的药物选择指导上，治疗过程中对癌况的监测以及预后的判断等方面有很大的帮助。

通过本研究我们了解到，DcR3与胆囊癌的密切关系，DcR3在胆囊癌组织中的表达与胆囊管状腺瘤组织、胆囊腺肌瘤病组织及慢性胆囊炎组织中DcR3有明显的区别，并且其表达的强弱与胆囊癌的临床病理分期有关，分期越晚，表达越强。提示DcR3与肿瘤的发生，肿瘤的免疫逃逸具有密切的联系，表达可能对判断胆囊癌的恶性程度、病情进展有重要价值，从而来指导临床的诊断、治疗、预后评价及肿瘤复发有着积极意义。

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（收稿：2014-04-20 修回：2014-11-22）

（责任编辑 石承先）

Decoy Receptor 3 Expression and Clinical Significance in Gallbladder Cancer

CHAIYou-long,KONG Di,ZHANGHui，etal.Surgical Oncology of TianJinNanKai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To explore the expression of DcR3 protein in gallbladder carcinoma tissue.MethodsDcR3 protein was detected by immunohistochemical SP method in the gallbladder, gallbladder tubular adenoma tissue, adenomyoma gallbladder diseases and chronic cholecystitis tissue of expression, trying to find out the variety of the relationship between clinical features.ResultsThe positive rate of DcR3 expression in gallbladder cancer tissues was 68.4%(26/38),the positive expression of DcR3 in tubular adenoma of the gallbladder,gallbladder adenomyomatosis and chronic cholecystitis tissues were 10%(2/20),18.6%(3/16)and 5.6%(2/26)correspondingly.The expression of DcR3 was well associated with lymph nodemetastasis and TNM stage(all P＜0.05).ConclusionThe expression of DcR3 in gallbladder carcinoma shows a high rate,especially in the increased expression of metastasis and clinical pathological stage of carcinoma of lymph node.The excessive expression of DcR3 in the occurrence and development of gallbladder plays an important role in the process.

Gallbladder carcinoma;decoy receptor 3;immunohistochemistry

R735.8

A

1007-6948(2015)01-0003-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.01.001

天津市南开医院1.肿瘤外科;2.病理科（天津 300100）

孔棣，E-mail：kongdi@126.com