温度和p H对白三叶草链格孢菌菌落生长的影响

王 斌

（甘肃农业职业技术学院，甘肃 兰州 730020）

白三叶草（Trifolium repens Linn.），中文异名白车轴草、白花苜蓿、白花车轴草、荷兰翘摇等，为豆科蝶形花亚科三叶草属多年生牧草。其营养价值好，柔嫩多汁，适口性好，产草量高，可作家畜、家禽的优质饲料和绿肥［1-3］。同时因其生长力强，繁殖容易，绿色期长，耐践踏，被广泛应用于城市绿化建设，是优良的绿化观赏草坪种［4］。

链格孢菌属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、链格孢属，全世界已经描述的约有500种［5］，其中90%以上的种是兼性寄生于不同科的植物上，可引起多种叶斑病，常称为黑斑病［6］。周晓燕报道的白三叶草黑斑病的病原有两种，一种为三叶草黑斑菌，属子囊菌亚门、座囊菌目、座囊菌科、黑斑座囊菌属，无性世代为三叶草黑斑集梗，属半知菌亚门、丛梗孢目、集梗屈顶霉属。另一种为三叶草多孢小球壳菌，属子囊菌亚门、座囊菌目、座囊菌科、多孢小球壳菌属［7］。李晶等报道，链格孢菌为安徽铜陵铜尾矿区的优势植物白车轴草叶斑病的主要致病菌［8］。白三叶草链格孢菌主要危害叶片、叶柄，通常为小而密集的黑色或乌黑色病斑，近圆形或不规则形，环境干燥时叶片枯黄早衰，严重影响白三叶草的应用价值和观赏性。笔者于2014年在甘肃农业职业技术学院植物保护实验室研究了温度和pH对白三叶草链格孢菌菌落生长的影响，以期为防治白三叶草链格孢菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试白三叶草叶片采自湖北省武汉市。PDA培养基配方为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL。主要仪器为超净工作台，恒温培养箱，生物显微镜。

1.2 病原菌的分离培养

选择具有典型症状的白三叶草叶片，洗净，晾干，取新鲜病斑病健交界部分，剪取边长4～5 mm的病组织数块，置于灭菌小容器内，用70%酒精漂洗2～3 s，然后用0.1%升汞溶液消毒1～2 min，再经无菌水漂洗3～4次，然后用灭菌的滤纸吸干水分。最后将病组织放到平板培养基上，25℃下进行培养，3 d后检查分离、镜检、转管、纯化。

1.3 柯赫氏法则印证

选取白三叶草健康的叶片，进行表面消毒，放在底层铺有吸水纸的搪瓷盘中，将纯化后的菌丝接种于PDA培养基上培养7 d（图1）。在菌落边缘用打孔器打取直径5 mm的菌饼接种在离体叶片上，以接种无菌的PDA培养基作为对照。25℃恒温下保湿培养。观察并记载发病情况，将发病叶片的病原菌再分离纯化并进行镜检。

图1 离体叶片接种

1.4 不同温度下菌丝生长观察

设 15、20、25、30、35、40℃ 6个温度处理，每处理3个重复。在培养7 d的菌落边缘用打孔器打取直径5 mm的菌饼，接种在不同处理培养基上，按设置温度恒温培养，7 d后观察记载菌落生长情况。

1.5 不同处理pH菌丝生长观察

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调PDA培养基的pH至5、6、7、8、9。每处理设3个重复。在培养7 d的菌落边缘用打孔器打取直径5 mm的菌饼，接种在不同pH培养基上，25℃下恒温培养，7 d后观察记载菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

如图2所示，在PDA培养基上菌落圆形，中部黄褐色至黑色，边缘为乳白色，短绒状。从图3看出，分生孢子梗褐色至暗褐色，分支或不分支，有隔。分生孢子棒状或倒棒状，暗褐色，0～3个纵隔，1～6个横隔。根据病原菌的形态特征，鉴定该病原菌为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、链格孢属真菌［8-10］。

2.2 温度对菌落生长的影响

从表1可以看出，PDA培养基培养7 d，25℃处理下菌落生长最快，平均直径为7.1 cm；其次是20℃处理，平均直径为5.6 cm。35℃处理下菌落生长最慢，平均直径为1.9 cm。40℃处理下平均直径大于35℃处理的平均直径，这可能跟实验误差有关。对菌落直径进行方差分析的结果表明，不同的温度条件对链格孢菌的生长有显著影响，其中25℃条件下与其余温度条件下各处理差异极显著；温度过低（15℃）或过高（35℃） 时菌落生长无显著性差异。

图2 菌落形态

图3 链格孢菌分生孢子梗及分生孢子形态

表1 不同温度对菌落直径的影响

2.3 pH对菌落生长的影响

通过表2可以看出，随pH增大，链格孢菌菌落直径呈先增大后减小趋势。当pH为6时，菌落生长速度最快，平均直径为9.0 cm；pH为7时，平均直径7.1 cm；当pH大于7时，菌落生长受到抑制；当pH为9时，菌落直径最小，为2.7 cm。对不同pH下菌落直径方差分析的结果表明，不同的pH对链格孢菌菌落的生长有显著影响。pH为6时，与其余各pH下的处理差异达极显著水平；pH为5和pH为8的处理之间差异不显著，均与pH为9的处理差异极显著。

表2 不同pH对菌落直径的影响

3 小结

1） 通过对白三叶草链格孢菌进行分离，纯化培养，观察其菌落形态、颜色、大小、生长速度，并在显微镜下观察其分生孢子梗和分生孢子的形态特征，鉴定该病原菌为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、链格孢属真菌。这与李晶等人报道的结果相吻合［8］。

2）温度、pH对菌落生长有一定的影响。在PDA培养基上，25℃处理下菌落生长最快，大于或小于25℃对菌落生长均有一定的抑制作用，故白三叶草链格孢菌生长的适温为25℃。pH为6时，菌落生长速度最快，pH大于7或小于6对菌落生长均有一定的抑制作用，故白三叶草链格孢菌在弱酸性的环境下生长速度最快。

［1］ 王彩梅.白三叶草在现代生态农业中的应用［J］.现代园艺，2013（3）：32-33.

［2］ 师仰胜，赵培宝.白车轴草病虫害的发生危害及其治理对策［J］. 植物保护，2005（6）：70-73.

［3］ 樊林志.苹果园种植三叶草对苹果产量和品质的影响［J］. 甘肃农业科技，2009（6）：20-21.

［4］ 岳临平.三叶草高产栽培技术［J］.甘肃农业科技，2014（8）：69-70.

［5］ 唐 岚，江厚利，王义勋，等.链格孢属真菌分类研究进展［J］. 湖北林业科技，2013（4）：47-49.

［6］ 陆家云.植物病原真菌学［M］.北京：中国农业出版社，2000，392-395.

［7］ 周晓燕.白三叶草黑斑病的发生及综合防治［J］.云南农业，2002（9）：13.

［8］ 李 晶，刘登义，王义勋，等.大白车轴草病原菌链格孢菌及其症状研究［J］.生物学杂志，2006（4）：32-34.

［9］ 杨晓平，胡红菊，王友平，等.梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察［J］.华中农业大学学报，2009（12）：680-684.

［10］ 赵远征，刘志恒，李俞涛，等.大樱桃黑斑病病原鉴定及其致病性研究［J］. 园艺学报，2013（8）：1 560-1 566.