四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠血清白细胞介素-1β、-4、肿瘤坏死因子-α的影响

四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠血清白细胞介素-1β、-4、肿瘤坏死因子-α的影响

王燕曹燕飞朱向东荀敏齐汪斌

(甘肃中医学院基础课部，甘肃兰州730000)

摘要〔〕目的观察四神丸对溃疡性结肠炎(UC)大鼠白细胞介素(IL)-1β、-4肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法Wistar大鼠40只分为四组，采用2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇灌肠法造模，光镜观察结肠组织病理形态并评分，采用酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清IL-1β、 TNF-α、IL-4的水平。结果模型组大鼠结肠组织黏膜层可见溃疡形成，且有明显的炎症、充血存在，证实造模成功。模型组大鼠血清IL-1β 、TNF-α含量均高于空白组(P<0.05)，而IL-4含量低于空白组(P<0.01)；治疗后，四神丸组血清IL-1β 、TNF-α水平均较模型组降低(P<0.05、P<0.01)，而IL-4含量却显著升高(P<0.01)。结论四神丸能够通过下调IL-1β、TNF-α的表达，升高IL-4的表达，调节肠道异常免疫反应、抑制炎症反应，修复溃疡，进而治疗UC。

关键词〔〕四神丸；溃疡性结肠炎；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-4

中图分类号〔〕R285.5〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：朱向东(1973-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中医药防治溃疡性结肠炎的应用基础研究。

Influence of the Si Shen Pill on the content of interleukin-1β,interleukin-4 and TNF-α in rats with ulcerative colitis

WANG Yan，CAO Yan-Fei，ZHU Xiang-Dong，etal.

Basic Department，Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influence of the Si Shen Pill on interleukin-1β (IL-1β) ，TNF-α and interleukin-4(IL-4)in ulcerative colitis (UC) rats.MethodsExperimental rats were divided into four groups.Model rats were made by means of the TNBS/ethanol enema.Colon organization pathological changes were observed by the light microscope.Serum IL-1β，TNF-α and IL-4 were detected by ELISA.ResultsUlceration，inflammation，congestion existed in colon mucosa of model rats，which meant the models were made successfully.IL-1β and TNF-α of model rats were higher and IL-4 was lower than those of rats in blank group(P<0.05，P<0.01).After treatment，compared with the model group，IL-1β and TNF-α were reduced and IL-4 was increased in the Si Shen Pill group(P<0.05，P<0.01).ConclusionsSi Shen Pill can reduce the IL-1β and TNF-α，increase IL-4，regulate immune abnormalities in intestines，inhibit inflammation，repair ulcers and cure UC.

【Key words】Si Shen Pill; Ulcerative colitis; IL-1β；TNF-α; IL-4

第一作者：王燕(1979-)，女，讲师，硕士，主要从事中医药防治溃疡性结肠炎的应用基础研究。

溃疡性结肠炎(UC)是常见的炎症性肠病，临床以腹痛腹泻、 黏液脓血便持续或反复发作为主要症状，具有癌变倾向。该病发病原因及机制尚不明确，尚缺乏满意的治疗方法，已被列为现代难治病之一。研究证实，四神丸对UC大鼠模型肠黏膜炎症有较好的改善作用，但其作用机制不清，本实验探讨四神丸对实验性UC大鼠白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-4的影响。

1材料与方法

1.1动物、试剂及仪器采用SPF级Wistar大鼠40只，体重(180±10)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXKC(甘)2004-0006；SPF级实验设施合格证号：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液(20090825)均购自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国Sigma公司生产，批号为(2008-16-2)；大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4检测试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司。酶标仪(美国BLO-RAD公司)；CT14RD高速冷冻离心机(天美科技有限公司)；303-2型恒温培养箱(北京科伟永鑫实验设备仪器公司)

1.2受试药物四神丸：由补骨脂，肉豆蔻，五味子，吴茱萸组成，药物购于甘肃中医学院附属医院，由甘肃中医学院附属医院药剂室制成含药3 g/ml浸膏剂，4℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶(SASP)每片0.25 g(批号：H32020026，上海三维制药有限公司生产)。

1.3造模方法采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kgTNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟，让动物保持平躺状态，自然清醒。第2天即UC造模成功。

1.3.1分组与给药、取材将实验动物分为四组：空白组、模型组、四神丸组及SASP组，每组10只。除空白组外均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合试剂灌肠。四神丸组组给予0.2 ml浸膏剂(含生药浓度分别为:2 g/ml)灌胃，SASP组按0.5 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 ml/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2天开始灌胃，1次/d，连续21 d。3 w后，乙醚麻醉后于股动脉采血，室温静置10～20 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清，检测指标。脱颈处死大鼠，剖取病变最明显处结肠5～8 cm，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗结肠，部分结肠组织以4%中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，光镜观察。

1.3.2结肠组织病理学及其评分参考结肠病理组织学评分标准〔1〕，由两位富有经验的病理教研室老师进行双盲评分：①炎细胞浸润：无0分，轻度1分，重度2分；②浸润深度：黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分；③溃疡深度：无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜肌层3分。

1.3.3指标检测采用双抗体夹心ELISA法测定IL-1β、TNF-α、IL-4，严格按试剂盒要求操作。在检测波长450 nm和校正波长620 nm同时读板，通过标准曲线，计算各样本含量。

2结果

2.1一般状态模型组大鼠在造模当天开始出现稀便，觅食较不主动，食量减少，肛周污浊，于1 w内体重略有下降，毛色晦暗无光泽且被粪便沾染，持续稀便，部分大鼠有血便且肉眼可见；四神丸、SASP组随着给药时间的持续，症状明显好转，大部分大鼠稀便症状消失，基本恢复正常，粪便呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮润泽，食量正常，活跃，体重略有增长。四神丸组比SASP组症状改善更为明显。

2.2结肠组织病理学及其评分模型组大鼠结肠组织有溃

疡，且溃疡面较大，溃疡深度大多至黏膜肌层；有明显的炎细胞浸润，且浸润深至全层；可见血管扩张充血、有糜烂，病变结肠黏膜可见中性粒细胞浸润，黏膜上皮层有缺失，固有层腺体明显减少及破坏，黏膜下层部分可见血管增生。四神丸组和 SASP组有程度不同的改善，其中四神丸组和阳性对照组比较，溃疡基本愈合，腺体增生愈合，有明显的愈合面存在。见图1，表1。

2.3四神丸对UC模型大鼠血清IL-β的影响与空白组比较，模型组大鼠血清IL-β含量显著增高(P<0.01)；与模型组比较，四神丸、SASP组IL-β含量均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.4四神丸对UC模型大鼠血清TNF-α的影响与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，四神丸、SASP组TNF-α含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.5四神丸对UC模型大鼠血清IL-4的影响与空白组比较，模型组大鼠血清IL-4含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，四神丸、SASP组IL-4含量显著升高(P<0.01)。见表1。

组别病理组织学评分IL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)IL-4(pg/ml)空白组0.75±0.5451.75±3.3546.53±11.84151.19±6.45模型组7.10±1.192)63.46±12.051)75.15±24.571)114.40±11.812)四神丸组4.17±1.404)51.31±5.023)50.93.±5.963)133.56±2.554)SASP组3.81±0.784)51.44±3.713)53.39±11.694)134.25±8.664)

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

空白组

模型组

四神丸组

SASP组

图1各组结肠组织HE染色结果(×10)

3讨论

UC是发病原因不明确的炎症性肠病，目前认为其发病与遗传、感染、环境影响、精神因素、免疫因素密切相关。由于本病存在病程长、反复发作、容易恶化等问题，属于难治性消化系统疾病。中医认为本病的发生是由于饮食、劳倦、情志损伤等因素导致五脏失调引起。本病发生虽然与饮食伤脾有关，但由于本病病程长，“五脏所伤、穷必及肾”，所以本病发病日久易引起肾虚。因肾主二便，肾虚则大便失约而为泄泻，临床治疗从“肾虚”论治UC是重要思路。四神丸是治疗五更泻的名方，临床用于治疗UC疗效显著，但其作用机制不明。关于UC发病机制的研究，目前比较公认的是免疫系统异常与本病密切相关〔2〕。其中抗炎因子与抑炎因子的失衡，是本病的重要发病机制。IL-1β和TNF-α是炎症反应中非常重要的促炎因子和调节免疫因子。TNF-α还参与肠道炎症起始与持续，是非常重要的炎症介质。TNF-α主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生，其促炎机制主要是参与激活中性粒细胞和上调黏附分子、促进肉芽肿的形成。TNF-α还能够加强单核巨噬细胞的吞噬功能，刺激IL-8、IL-1等其他细胞因子合成释放，产生细胞因子的瀑布效应，促进炎症反应的扩大〔3〕。IL-1β有多种生物学效应，IL-1β能够使免疫上调和促进炎症活性，能通过自分泌或旁分泌促进其下游细胞因子(如TNF-α)的表达和产生，并和其共同作用，引起一系列肠黏膜损伤和肠道炎症反应。IL-1β还通过促进白细胞黏附分子的表达，使趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，引发一系列肠组织破坏和肠道炎症反应〔4〕。IL-1β不仅作为重要促炎因子参与UC的急性期〔5〕，在UC发生的初始阶段发挥重要活性，它还可反馈性的促进T淋巴细胞和巨噬细胞产生IL-2,IFN-γ等表达来使炎症反应加速。

UC的重要发病机制之一可能是Th1/Th2亚群失衡。Th2细胞主要分泌IL-10、IL-4、IL-6等。研究认为IL-4在UC中减少非常明显，也有研究表明UC患者IL-4基因表达减少〔6〕。IL-4可以刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，抑制NO、其他细胞因子(如IL-1、TNF-α等)，并抑制巨噬细胞和T淋巴细胞的产生和移动，从而抑制IL-1的促炎作用〔7〕，正常状态下，人体肠黏膜能自发的分泌抗炎因子如IL-4来维持肠道免疫，IL-1β则较少分泌，二者维持动态平衡。当受到病原刺激后，则这种平衡破坏，促炎因子升高，抗炎因子降低，则肠道炎症发生，所以，IL-4和IL-1β在消除和抑制肠黏膜炎症，维持肠道免疫平衡中起关键作用〔8，9〕。本结果显示，四神丸治疗UC的机制之一可能是抑制了UC上调的促炎因子IL-1β、TNF-α的表达，升高了抗炎因子IL-4的表达，从而调整了抗炎因子与抑炎因子的平衡，纠正了肠道异常免疫反应，使肠黏膜组织修复、炎症和溃疡消除。中医复方治疗炎症性疾病是从调整脏腑功能角度恢复人体的失衡，而非直接对炎症的抑制，中医复方治疗UC的更多机制需要进一步研究。

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〔2013-07-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)