海藻糖对异氟烷诱导转APP基因小鼠学习记忆功能的影响

海藻糖对异氟烷诱导转APP基因小鼠学习记忆功能的影响

张成媛朴美花刘楠苑野冯春生

(吉林大学第一医院麻醉科，吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨吸入麻醉药异氟烷对转APP基因小鼠学习记忆功能的影响及海藻糖的干预保护作用。方法60只12月龄转APP小鼠随机分为空白对照组(Control组)、异氟烷组(Iso组)、海藻糖组(Iso+Tre组)，每组20只。Iso+Tre组和Iso组分别于麻醉前30 min腹腔注射海藻糖400 μg/kg或等量生理盐水，然后给予1.4 %异氟烷吸入麻醉2 h，麻醉后24 h应用Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力，麻醉后6、24 h杀鼠取脑，采用TUNEL染色观察各组小鼠海马区神经元凋亡，应用ELISA法检测Aβ含量，Western印迹法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达变化。结果与Control组相比，Iso组小鼠总体的平均逃避潜伏期明显延长，空间探索时间明显缩短(P<0.01)，海马神经元凋亡指数、Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表达均明显增加(P<0.01)；Iso+Tre组与Iso组相比，逃避潜伏期缩短，空间探索时间延长(P<0.05)，Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表达均明显减少(P<0.01)。结论海藻糖能够改善异氟烷诱导转APP基因小鼠学习记忆能力的损害，减少海马神经元的凋亡及Aβ的生成。

关键词〔〕海藻糖；异氟烷；学习记忆；β-淀粉样蛋白；神经元凋亡

中图分类号〔〕R338；R614〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 81271215；No.81141065)

通讯作者：冯春生(1971-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事麻醉学研究。

第一作者：张成媛(1984-)，女，在读硕士，主要从事全麻药对学习记忆功能的影响及其机制研究。

Effects of trehalose on learning and memory impairment induced by isoflurane in APP transgenic mice

ZHANG Cheng-Yuan, PIAO Mei-Hua, LIU Nan,etal.

Department of Anestic, the First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influence of inhalation anesthestic isoflurane on the learning-memory ability of APP transgenic mice and protective effects of trehalose.Methods60 APP transgenic mice at the age of 12 months were divided into control, Iso and Iso+Tre groups. The abilities of learning and memory were investigated by Morris water maze. TUNEL assay was employed to observe the hippocampal neuron apoptosis of the mice in each group. The amount of Aβ was checked by ELISA assay kit and the variations of Bcl-2, Bax, Caspase-3 were examined by Western blot.ResultsIn comparison with those of control group, the mean escape latency of Iso group was prolonged, the spatial exploring time was reduced, apoptotic index, the amount of Aβ, the ratio of Bax/Bcl-2, and the expression of Caspase-3 were increased. Moreover, compared to those of Iso group, escape latency of Iso+Tre was shorter, longer spatial exploring time was longer, the amount of Aβ, ratio of Bax/Bcl-2, and Caspase-3 expression were lower.ConclusionsTrehalose could improve the recovery of the learning and memory of APP transgenic mice after isoflurane anesthesia, the hippocampal neuron apoptosis and the production of Aβ can be inhibited by trehalose.

【Key words】Trehalose; Isoflurane; Learning and memory; Amyloid β-peptide; Neuron apoptosis

一些研究认为〔1，2〕，异氟烷等吸入麻醉药可能引起神经细胞凋亡，增加β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积，加重阿尔茨海默病(AD)患者的认知功能障碍，成为AD发生发展的潜在危险因素。海藻糖是一种稳定的非还原性二糖，因其对生物分子的特殊保护作用，目前已广泛应用于医学领域。目前已有报道认为〔3〕，海藻糖能够减轻Aβ寡聚体的神经毒性，抑制细胞死亡，阻断和逆转神经退行性疾病的病理过程。本研究以转淀粉样前体蛋白(APP)基因小鼠作为AD动物模型，观察海藻糖对吸入麻醉药异氟烷诱导转APP小鼠空间学习和记忆功能损害的影响。

1材料和方法

1.1实验动物及分组12月龄转APP基因小鼠60只(吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供)，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为三组(n=20)：空白对照组(Control组)、异氟烷组(Iso组)、海藻糖组(Iso+Tre组)。

1.3方法

1.3.1模型制备Iso+Tre组于麻醉前30 min给予腹腔注射海藻糖(400 μg/kg，稀释于2 ml生理盐水中)，Iso组腹腔注射2 ml生理盐水。将转APP基因小鼠置于自制的麻醉箱中，并连于麻醉机螺纹管回路中，吸氧浓度60%，氧流量1 L/min，先给予转APP基因小鼠3 %异氟烷进行麻醉诱导，待翻正反应消失〔约(10±2)min〕后，给予1.4 %异氟烷持续吸入2 h，Control组不给任何药物，只吸入含60%氧气的空氧混合气体2 h。麻醉过程中维持小鼠自主呼吸，观察小鼠皮肤颜色及呼吸频率，麻醉结束后置于氧浓度为60 %的环境中自然苏醒。

1.3.2行为学检测每组随机抽取8只转APP基因小鼠于麻醉后24 h开始进行Morris水迷宫实验，水池直径120 cm，高60 cm，水温(25±1)℃，等分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，实验历时6 d，第1～5天为定位航行实验，圆形平台直径6 cm，置放于第Ⅲ象限正中，低于水面1 cm。分别将三组小鼠从4个象限面向池壁放入水中，入水至登上隐蔽平台的时间为逃避潜伏期，每只小鼠每天于固定时间段训练4轮，计算某时间段的平均逃避潜伏期。第6天将平台撤除，进行空间探索实验，选定和原平台区域对应的象限终点为入水点，记录小鼠120 s内在原平台所在象限的滞留时间，即为空间探索时间。

1.3.3海马组织切片原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色异氟烷麻醉结束后6 h，每组随机抽取6只转APP基因小鼠，灌注固定后杀鼠取脑，石蜡包埋后，在视交叉后1～4 mm处切取10 μm的冠状位脑片，每隔5片选一片，每只小鼠选用3张脑片，常规脱蜡水合后加入蛋白酶K，37℃孵育30 min，每个样本加入50 μl TUNEL反应混合液(50 μl TdT+450 μl荧光素标记的dUTP)，阳性对照样本加入100 μl DNase I反应液，阴性对照样本中加入50 μl不含TdT酶的反应液，加入含HRP的荧光素抗体37℃孵育30 min，选用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染后，400倍显微镜下观察凋亡细胞，镜下出现细胞核呈桔红色、胞质不着色、染色质呈块状凝聚或裂解成颗粒状的细胞，即为阳性染色细胞。

1.3.4ELISA法检测Aβ1～42含量麻醉结束后24 h将每组剩余6只转APP基因小鼠处死，分离海马组织，取一侧海马称重后超声粉碎10～15次，17 000 r/min，4℃离心1 h，取中间层含Aβ的组织液作为ELISA检测的样本，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.3.5Western印迹检测Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达取小鼠另一侧海马，加入细胞裂解液提取海马总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，0.5%脱脂奶粉封闭2 h后加入Ⅰ抗，即兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗体(1∶1 000)，孵育过夜，常规洗膜后与Ⅱ抗即HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶2 000)室温反应1 h，洗膜后采用Image J软件测定各条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与相应β-actin灰度值的比值作为Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表达水平。

#0是规模最大的聚类，主要研究高端模拟教学试验、多种教学法相结合、团队合作学习在护理学基础教学中的应用价值与应用效果以及病理学、临床微生物学、药学等学科的实验教学体系的应用、改革与创新；#1主要研究循证护理、术后护理与术后健康教育、并发症、术中护理安全及防范措施等；#2主要研究早期糖尿病肾病评估与诊断以及糖尿病肾病的临床护理与治疗；#3主要研究植物药材挥发油的抗肿瘤作用及其化学成分的研究；#4主要研究轴扫技术在CT腹部检查中的作用以及体层摄影术在临床检查、诊断中的应用价值。

2结果

2.1Morris水迷宫实验

2.2.1定位航行试验随着训练次数的增加，各组小鼠平均逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势。第1天至第4天，Iso组平均逃避潜伏期〔(72.69±12.15)s〕与Control组〔(51.23±10.29)〕s相比明显延长(P<0.01)；Iso+Tre组〔(55.06±12.35)s〕与Iso组相比逃避潜伏期缩短(P<0.05)；第5天3组小鼠逃避潜伏期均无明显差异(P<0.05)。见图1。

图1　各组转APP基因小鼠平均逃避潜伏期趋势图

2.1.2空间探索实验Iso组空间探索时间〔(28.85±5.41)s〕比Control组〔(41.25±8.32)s〕明显缩短(P<0.01)；Iso+Tre组〔(38.01±7.51)s〕与Iso组比较，空间探索时间明显延长(P<0.01)；Iso+Tre组与Control组相比无明显差异(P<0.05)。

2.2TUNEL染色结果海马神经元凋亡指数(AI)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100 %。Iso组阳性细胞较多，细胞核呈橘红色，胞质不着色，染色质呈块状凝聚或裂解成颗粒状，使圆形核致密深染或见多个细小颗粒聚集，Iso组神经元凋亡指数(0.713%±0.041%)明显高于Control组(0.159%±0.065%)(P<0.01)，Iso+Tre组神经元凋亡指数(0.287%±0.094%)比Iso组明显降低(P<0.01)，但与对照组相比仍有差异(P<0.05)。见图2。

图2　各组小鼠海马CA1区神经元凋亡

2.3ELISA检测结果Iso组Aβ1～42含量〔(9 908.18±1 103.44)pmol/g脑组织〕明显高于Control组〔(7 858.21±1 003.12)pmol/g脑组织〕(P<0.01)；Iso+Tre组〔(8 025.41±668.75)pmol/g脑组织〕与Iso组相比较，Aβ1～42含量明显下降(P<0.01)，与Control组比较无明显差异(P<0.05)。

2.4Western印迹检测结果与Control组相比，Iso组小鼠海马组织Caspase-3 、Bax基因表达显著增强，Bax/Bcl-2比值升高，Bcl-2基因表达减少(P<0.01)；Iso+Tre组比Iso组小鼠海马组织Caspase-3、Bax基因表达明显减少，Bax/ Bcl-2比值降低，Bcl-2基因表达增加(P<0.01)，但与Control组相比仍有差异(P<0.01)。见表2，图3。

组别Bcl-2BaxCaspase-3Bax/Bcl-2Control组1.141±0.2510.104±0.0230.152±0.0240.089±0.029Iso组0.325±0.0521)1.302±0.2111)1.125±0.2211)4.112±0.0241)Iso+Tre组0.711±0.1541)2)0.412±0.0531)2)0.534±0.0751)2)0.578±0.0221)2)

与Control组比较：1)P<0.01；与Iso组比较：2)P<0.01

图3　各组小鼠海马组织Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达

3讨论

转APP基因小鼠是目前应用最广泛的AD动物模型之一，其相关的病理改变与人类相似，过度表达突变的人类APP基因，导致Aβ1～42沉积、斑块形成，9月龄即可表现出认知功能下降，可用于排除手术等环境因素的干扰，单独讨论麻醉对AD病理过程的影响〔4〕。

Morris水迷宫实验是评估啮齿类动物学习记忆能力的重要手段之一，考察实验动物的空间定向和定位能力，对海马结构受损尤其敏感。本实验结果说明异氟烷能够损害小鼠的学习记忆功能，这种损害的程度可能随着时间推移减弱，提示异氟烷麻醉可能对转APP基因小鼠的远期认知功能有所影响；而麻醉前给予海藻糖能够明显缩短异氟烷麻醉后小鼠的逃避潜伏期，延长其空间探索时间，表明使用海藻糖干预能在短时间内阻止异氟烷诱导转APP基因小鼠的学习记忆功能损害。

AD的病理改变包括老年斑形成、神经元纤维缠结、神经元减少等，细胞凋亡是引起神经元减少的重要原因。海马结构在学习记忆过程中起至关重要的作用，也是AD患者最早、最易受损的部位，海马神经元凋亡破坏了神经网络系统的完整性，是AD发病的重要机制〔5〕。Bcl-2家族和Caspase在线粒体凋亡通路中具有重要意义。Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；一类为促凋亡基因，代表基因为Bax基因〔6，7〕。Bcl-2蛋白能与Bax蛋白形成Bcl-2-Bax异源二聚体，抑制Bax的作用，保护细胞不进入凋亡程序，因此观察Bcl-2与Bax的比值比二者的绝对量更有意义。常用吸入麻醉药异氟烷具有潜在的神经毒性作用，有研究证实其通过对Bcl-2和Bax的差异性影响，导致Caspase-3的表达和活性改变，进而引起脑神经凋亡〔8〕。此外，Bcl-2家族蛋白能和线粒体膜上的其他孔蛋白相互作用，形成一个无选择性的通透性转换孔(PTP)。Zhang等〔9〕的研究发现，异氟烷能够通过增加活性氧类物质的产生，诱导线粒体通透性转换孔打开，导致线粒体被破坏，线粒体膜蛋白含量减少，降低ATP的水平，进一步引起Caspase家族激活以及细胞凋亡，最终产生学习和记忆功能的损害。

Aβ是老年斑的核心成分，最近有研究证实，在表现出明显的认知功能障碍或痴呆症状之前的10～15年，即可发生Aβ蛋白水平升高、聚集和形成斑块等一系列早期病理改变〔10〕。Aβ由APP经β分泌酶和γ分泌酶作用后生成，有Aβ1～40和Aβ1～42两种形式，Aβ1～40含量较多，可见于正常老年人及AD患者；Aβ1～42主要见于AD患者脑中，更易于聚集，具有很强神经毒性〔11〕。Aβ1～42的异常聚集形成淀粉样斑块是各种原因诱发AD的共同通路，与Aβ1～40相比，患者脑脊液中Aβ1～42浓度的改变更能反映AD的严重程度〔12〕。Aβ寡聚体通过激活小胶质细胞，释放补体、细胞因子、自由基等免疫分子，从而造成神经元功能损害〔13〕。此外，体外试验证实，Aβ1～42能够引起Bax/Bcl-2比值升高，决定细胞受诱导后更倾向于凋亡〔14〕。结果表明长时间吸入异氟烷麻醉使转APP基因小鼠脑内Aβ1～42含量明显升高，加速AD模型小鼠的神经退行性改变，这与Perucho等〔2〕的研究结果相类似。

海藻糖是一种安全的天然糖类，对生物分子具有特异性保护作用，目前未见与剂量相关的不良反应。本实验结果表明，麻醉前给予海藻糖干预，能够有效拮抗异氟烷引起的转APP基因小鼠海马结构的病理改变，作用于线粒体凋亡通路，抑制Bcl-2、Bax、Caspase-3的活化，减少神经元凋亡并能降低海马Aβ的含量，从而有效改善转APP基因小鼠的学习和记忆功能，为寻找更加安全有效的麻醉方案提供了实验依据。

4参考文献

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〔2013-12-02修回〕

(编辑袁左鸣)