胸苷酸合酶基因遗传多态性与股骨头坏死的关联性

胸苷酸合酶基因遗传多态性与股骨头坏死的关联性

吴昌新吴国志王晖陈文生

(海南省农垦总局医院骨科，海南海口571101)

摘要〔〕目的探讨胸苷酸成酶(TS)5′非编码区28 bp重复序列(rs34743033)及3′非编码区遗传多态性(rs34489327)与海南中老年人群股骨头坏死的关联性。方法选择海南省股骨头坏死患者216例作为实验组，健康对照216例作为对照组，利用PCR方法及焦磷酸测序法检测胸苷酸合成酶基因的遗传多态性。结果TS 基因rs34743033多态位点3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型实验组中的分布频率为79例(36.6%)、68例(31.5%)、69例(31.9%)，在对照组中为103例(47.7%)、76例(35.2%)、37例(17.1%)，组间差异显著(χ2=13.27，P<0.05)。与其他两种基因型相比，3R/3R在实验组中的分布频率明显低于对照组(P<0.05),而2R/2R的频率明显高于对照组。TS基因rs34489327多态性位点可检测出三种基因型，+6 bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在实验组中的分布频率为68例(31.5%)、83例(38.4%)、65例(30.1%)，在对照组中为95例(44.0%)、78例(36.1%)、43例(19.9%)，组间差异显著(χ2=13.27，P<0.05)。与其他两种基因型相比，+6 bp/+6 bp在实验组中的分布频率明显低于对照组(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的频率明显高于对照组。结论基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp可能是股骨头坏死的危险因素。

关键词〔〕股骨头坏死;胸苷酸合酶;股骨头坏死;基因多态性

中图分类号〔〕R68〔

第一作者：吴昌新(1969-)，男， 副主任医师，主要从事骨科疾病的临床与科研工作。

胸苷酸合酶(TS)基因定位于第18号染色体上18p11.32，其编码的TS是嘧啶核苷酸合成的限速酶，控制体内胸苷酸的合成，与细胞分裂等生命活动密切相关〔1〕。5’UTR和3‘UTR的核苷酸序列及结构是影响基因表达水平的重要因素。TS基因5’端转录起始点上游存在28个碱基对(bp)的串联重复序列(VNTR )结构，该序列与多种转录调节蛋白结合后可能刺激和增强启动子的活性，从而影响基因表达效率〔2〕；该序列存在个体差异，在GenBank中的序列号为rs34743033。TS基因3’端1 494 bp处存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入(rs34489327)，该多态性可能通过影响TS mRNA的稳定性从而影响TS基因的表达〔3〕。股骨头坏死是严重影响患者生命质量的骨科疾病，目前临床上没有特效方案。本文拟探讨TS UTR多态性与股骨头坏死的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选取海南省2010～2013年股骨头坏死患者216例作为实验组，男151例，女65例，年龄40～65岁，平均58岁，病程1～15年。选择216例健康人群作为对照组，男151例，女65例，年龄45～65岁，平均57.6岁。排除创伤性股骨头坏死、器质性疾病、慢性病、骨质疏松等患者。

1.2基因多态性检测①DNA提取：采用QIAamp®DNA Blood Kit提取全血DNA，采用NanoDrop2000微量紫外分光光度计(Thermo SCIENTIFIC)进行质量控制。② TS基因5’端重复序列检测：采用PCR扩增加琼脂糖凝胶电泳的方法检测TS基因5’端转录起点上游附近存在的28 bp的NVTR多态性。设计上游引物：5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’，下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，2R/2R基因型扩增片段为222 bp，3R/3R基因型大小为250 bp，2R/3R基因型出现222 bp和250 bp的两条带。反应体系：2倍QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10 μl，上游引物和下游引物各0.2 μl，模板DNA 2 μl，灭菌蒸馏水补足至20 μl。反应条件：98℃预变性15 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，60 s，40个循环。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。分型结果的判定方法：出现一条222 bp的单一条带为2R/2R基因型，出现一条250 bp的单一条带为3R/3R基因型，出现222 bp和250 bp两条带则为2R/3R基因型。③3’端UTR多态性(3’非编码区的1 494 bp处6 bp核苷酸片段的缺失或插入)检测：采用焦磷酸测序技术进行3’端UTR多态性检测。上游引物5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’， 下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，测序引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，其中下游引物5’末端进行生物素标记。

1.3统计学分析利用SPSS16.0软件行χ2检验。

2结果

如表1所示，TS基因5’端非编码区3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型分布频率组间差异显著(χ2=13.27，P<0.05)。与其他两种基因型相比，3R/3R在实验组中的分布频率明显低于对照组(P<0.05),而2R/2R的频率明显高于对照组。TS 基因3’端非编码区1 494 bp处6 bp核苷酸片段的缺失或插入多态性位点可检测出三种基因型，+6bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在实验组与对照组中的分布频率差异显著水平(χ2=9.1，P<0.05)。与其他两种基因型相比，+6 bp/+6 bp在实验组中的分布频率明显低于对照组(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的频率明显高于对照组。

表1股骨头坏死患者与健康对照组非编码区两个遗传多态位点的基因型比较〔n(%),n=216〕

突变位点基因型实验组对照组χ2值P值5'UTRrs347430333R/3R79(36.6)103(47.7)13.270.0012R/3R68(31.5)76(35.2)2R/2R69(31.9)37(17.1)3'UTRrs34489327+6bp/+6bp68(31.5)95(44.0)9.10.01+6bp/-6bp83(38.4)78(36.1)-6bp/-6bp65(30.1)43(19.9) +6bp/-6bp+-6bp/-6bp148(68.5)3)121(56.0) +6bp/+6bp+6bp/-6bp151(69.9)4)173(80.1)

与3R/3R比较：1)P<0.05；与2R/2R比较：2)P<0.05；与+6 bp/+6 bp比较：3)P<0.01;与-6 bp/-6 bp比较：4)P<0.05

3讨论

股骨头坏死是严重影响患者生存质量的一类骨科疾病，其病因和发病机制较为复杂，是由多重遗传学因素与环境因素相互作用，众多病理过程参与，引起股骨头发生部分或者完全性缺血导致骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞坏死而导致的疾病〔4〕。

组织缺血是股骨头坏死的直接病因，在创伤性股骨头坏死过程中，毛细血管细胞的分裂有密切关联。TS是体内胸苷酸合成的限制酶，控制细胞分裂过程中DNA的生物合成过程，对细胞周期具有重要影响。 Shintani等〔5〕研究发现，rs34743033基因型与mRNA表达水平存在相关性。TS基因3’端1 494 bp处存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入，其多态性也可能通过影响TS mRNA的稳定性从而影响TS基因的表达。Mandola等〔6〕通过体外荧光标记检测、体内测定mRNA水平的方法发现，包含+6 bp多态基因型的荧光活性和mRNA水平出现了约35%的衰减，而包含-6 bp的基因型出现了约70%的衰减；同时含有-6 bp的基因型与含有+6 bp的基因型相比出现了较高的降解率；+6 bp/+6 bp基因型的TS mRNA水平明显高于-6 bp/-6 bp基因型。因此他们认为-6 bp等位基因在体外降低TS mRNA的稳定性，在体内降低TS的表达。

本研究结果显示，基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp不能是股骨头坏死的危险因素。

4参考文献

1Ofi T,Takahashi E.Ayuzawa D，etal．Regional assignment of the human thymidylate synthasc(TS) gene to chromosome band 18pl1.32 by nonisetopic in situ by hybridization〔J〕.Hum Genet,1990;85(5):576-80．

2Lacopetta B，Grieu F，Joseph D，etal．A polymorphism in the enhancer region of the thymidylate synthnse promoter influences the survival of colorectal cancer patients treated with 5-fluomuraeil〔J〕．Br J Cancer，2001;85(7)：827-30．

3Rich CM，Bigier J，Velicer CM，etal.Searching expressed sequence tag database：discovery and confirmation of a common polymorphism in the thymidylate synthase gene〔J〕.Cancer Epidemiol Biomark Prev，2000;9：1381-5.

4韩金宝,毕郑钢.老年股骨头缺血坏死的临床诊断及治疗现状〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(5)：1089-91.

5Shintani Y，Ohta M，Hirabaynshi H，etal．New prognostic indicator for non-small-cell lung cancer，quantitation of thymidylate synthase by real-time reverse transcription polymemse chain reaction〔J〕．Int J Cancer，2003;104(7)：790-5．

6Mandola MV,Stochlmaeher J,Zhang W，etal．A 6 bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associat-ed with decreased intratumoral TS mRNA levels〔J〕．Pharmacogenetics，2004;14：319-27．

〔2013-07-11修回〕

(编辑徐杰)