人Smad 4基因在胶质瘤细胞中的作用研究

刘宝辉 田道锋 王军民 李明昌 董慧敏 张申起 蔡 强 陈谦学



人Smad 4基因在胶质瘤细胞中的作用研究

刘宝辉 田道锋 王军民 李明昌 董慧敏 张申起 蔡 强 陈谦学

【摘要】目的 构建人Smad 4基因质粒体并检测其在胶质瘤细胞系U251内的表达水平及作用。方法构建PEGFP－Smad4质粒体，应用FUGENE HD转染质粒体进入U251，G418筛选，挑出单克隆扩增，建立稳定细胞株N1－U251和Smad4－U251。将实验分为空白组（U251细胞）、N1组（空质粒－U251）、Smad4组（Smad4－U251），检测Smad4基因和蛋白表达水平；使用CCK8法检测空白组、N1组、Smad4组细胞活性。使用流式细胞术检测细胞凋亡率，使用免疫印迹技术检测Caspase 3与p－Histone H3蛋白表达水平。结果PEGFP－Smad4质粒体构建成功，N1－U251，Smad4－U251稳定细胞株构建成功，CCK8显示空白组、N1组、Smad4组细胞活性分别是1±0．03、0．95±0．04、3．22±0．13，Smad4组与N1组比较，差异明显（P＜0．05），免疫印迹显示高表达Smad 4组pHistoneH 3表达水平明显增高；空白组、N1组、Smad 4组在经替莫唑胺化疗处理后细胞凋亡率分别为0．36±0．09、0．38±0．11、0．21±0．03，Smad 4组与N1组比较，差异明显（P＜0．05）；免疫印迹显示高表达Smad 4组Caspase 3表达水平明显降低。结论 成功构建人Smad4质粒体并建立高表达Smad4的细胞系，高表达Smad4可以提高U251细胞活性，降低化疗敏感性。

【关键词】Smad4 U251细胞 质粒体 细胞活性 化疗敏感性

【DOI】 10．3969／j．issn．1007－0478．2015．05．009

转换生长因子β（transforming growth factorβ，TGF－β）控制细胞的生长、分化、凋亡以及胚胎的发育，激活细胞膜上的I型和Ⅱ型受体，其中主要是I型受体，I型受体进一步激活Smad家族蛋白，调节相关基因的表达。在Smad家族中Smad4与肿瘤的关系尤为密切［1］，Smad4又称DPC4（deleted inpancreatic cancer 4）是通路中调节转录的核心分子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［2～4］，我们前期研究发现，Smad4在胶质瘤中表达异常［5］，但迄今为止其在胶质瘤中的作用尚不明确，本实验通过构建Smad4质粒，并构建稳定细胞系，研究Smad4在胶质瘤中的作用，为Smad4在胶质瘤中的作用研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 β－actin及羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。Smad4单克隆抗体购自英国Abcam公司，DMSO购自武汉天源生物技术公司。胎牛血清购自杭州四季青生物材料公司，Trizol Reagent购自美国英杰生命技术公司，DMEM培养基及胰蛋白酶购自美国Gibico公司，逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司。FGGENE HD购自Roche公司。G418购自Gibco公司。

1．2 质粒体的构建与鉴定 取对数期生长的U251细胞，提取RNA，逆转录并进行PCR。上游引物为：5’－ATCCTCGAGACCATGAAGTTATGGGATGTCG－3’，下游引物为：5’－ATCGTCGACATACATCCACACCTTTTAGC－3’下划线表示酶切位点，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用快速凝胶回收试剂盒回收纯化PCR凝胶电泳产物，氯化钙法制备新鲜的的大肠杆菌DH5α感受态细菌50μL，取1μL连接反应产物，混匀，电转仪电转，过夜培养后，用铜针挑去阳性菌落扩增，质粒小量抽提试剂盒抽提质粒。具体操作按说明书。使用SalI 和XhoI双酶切鉴定。配成酶切体系后，37℃水浴2h，取20μl行0．8%琼脂糖电泳，同时，将质粒体送上海博亚生物技术有限公司测序。

1．3 细胞培养 人恶性脑胶质瘤株U251（引自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，另添加适量Hepes和3%谷氨酰胺。每3d以含EDTA的0．25%胰酶消化，1∶3传代。

1．4 实验分组 空白组又称Ctrl组，仅给予转染试剂，N1组：转染PEGFP质粒，Smad4组：转染PEGFP－Smad4质粒。

1．5 稳定细胞株的构建 对数期生长的U251细胞经含EDTA的胰酶（0．25%）消化后计数2×105／孔接种于6孔板，培养过夜，弃去培养基，PBS洗3次，换成等体积OPTI－MEM培养基；将FUGENE HD加入空白OPTI－MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入质粒体后，混匀，室温放置10min，加入培养板中，以加空白FUGENE HD的U251细胞作为阴性对照；6h后将细胞培养基换成DMEM完全培养基；24h后加入G418筛选，浓度为预实验确定的1 000μg／mL，3d换1次液体，15d后将G418浓度调整为500μg／mL，继续加压筛选；20d后细胞形成单克隆，用1mL注射器针头挑取单克隆，接种于96孔板内，继续加压培养，6d，细胞铺满96孔板，将细胞消化后接种于6孔板内继续培养。

1．6 荧光定量PCR

U251细胞按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。RT–PCR步骤按照Promega公司试剂盒及其说明书进行。荧光定量PCR在ABI Prism 7500（Applied Biosystems）系统上完成，应用SYBR Green（TOYOBO，Japan）作为双链DNA特异荧光染料。Smad4上游引物5’－AACGGAGACATACAGCACCC－3’，下游引物为5’－GTAAGCGATGGAACACCAATAG－3’；GAPDH（internal control）上游引物5’－GAGTCAACGGATTGGTCGT－3’，下游引物为5’－TTGATTTTGGAGGGATCTCG－3’。

1．7 蛋白印记技术 含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50 mmol／L tris－HCL、pH 7．4，0．5 mmol／L EDTA，0．5%NP40和150mmol／L NaCl）裂解细胞，裂解物12 000r／min离心10min弃沉淀，BCA试剂盒定量蛋白浓度；取蛋白20μg以10%SDSPAGE电泳分离，PVDF转膜，Smad4、Caspase 3、p－Histone H3蛋白200mA 30min；5%脱脂牛奶室温封闭1h；Smad 4、Caspase 3、p－Histone H3鼠抗人单克隆抗体（1∶1 000）羊抗鼠二抗（1∶5 000），βactin（1∶2 000）羊抗鼠二抗（1∶3 000）作为对照，一抗孵育4h后TBST洗膜6min×5次，二抗孵育1h 后TBST洗膜6min×5次，滤纸吸干水分，加入及ECL增强试剂盒显色，根据条带亮度调整柯达胶片曝光时间，曝光后将胶片分别放入显影定影液5min。

1．8 细胞活性检测 采用CCK－8法检U251的细胞活性。在U251细胞种于96孔板，每个孔中加入10%的CCK－8，避光孵育2h后全自动酶标仪检测其450nm的吸光度值（A值），分别计算计算细胞抑制率＝（1－处理组平均A值／空白组A值）×100%。实验重复3次，取其均值。

1．9 细胞凋亡率的测定对数期细胞，5×105／孔接种于6孔板中，12h后加入化疗药物替莫唑胺（16 ug／mL），48h后使用流式细胞术检测细胞凋亡率，具体实验步骤按照试剂盒说明进行，实验重复3次，取其均值。

1．10 统计学处理 采用SPSS 17．0统计软件，数据采用均数±标准差（珚x±s）表示，单向方差分析进行样本均数间比较。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 PEGFP－Smad4质粒体构建成功

应用Sall和Xhol双酶切后电泳（图1），将Smad 4质粒体应用FUGENE HD瞬转染入U251细胞，Smad 4组Smad 4蛋白表达水平明显升高（图2）。

图1　质粒体PEGFP－Smad 4酶切图及稳定细胞系的建立

2．2 PEGFP－Smad4－U251稳定细胞株构建成功

荧光图片显示N1（空质粒）组与PEGFP－Smad 4组发出绿色荧光（图2），RT－PCR显示空白组、N1组、Smad 4组的Smad 4基因表达水平为1±0．14、0．95±0．09、3．2±0．41，Smad 4组与空白组比较差异明显（P＜0．05）（图2）。Western blot显示Smd 4组的Smad4蛋白表达水平明显升高，与空白组比较差异明显（P＜0．05）（图2）。

2．3 Smad4可以提高U251细胞活性

CKK8显示，对照组、N1组、Smad4组分别为1 ±0．03、0．95±0．04、3．22±0．13，Smad 4组与N1组比较，差异明显（P＜0．05）（图3），免疫印记显示高表达Smad 4后反应细胞增殖能力的p－Histone H3表达水平明显增加（图3）。

图2　稳定细胞系中Smad4的表达

图3　稳定细胞系细胞活性改变

2．4 Smad4可以降低U251细胞化疗敏感性

流式细胞术显示，空白组、N1组、Smad4组在经过替莫唑胺（TMZ）处理后细胞凋亡率分别为0．36±0．09、0．38±0．11、0．21±0．03，Smad4组与N1组比较，差异明显（P＜0．05）（图4），免疫印记显示高表达Smad 4后反应细胞凋亡的Caspase 3表达水平明显降低（图4）。

3 讨 论

Smad 4是TGF－β／Smad信号通路下游的重要因子，在调节细胞的生长和分化方面起关键性的作用。有研究表明，当细胞内TGF－β／Smad信号通路异常时肿瘤细胞异常侵袭［6－7］。Smad 4与多种肿瘤相关［7－8］，与前列腺癌及肺癌患者的预后密切相关［2，4］。我们前期研究也发现，Smad 4在胶质瘤中也表达异常［5］，提示Smad4可能在肿瘤的发生发展中发挥作用。

图4　稳定细胞系细胞对化疗药的敏感性

本实验结果显示，Smad 4可以增加人脑胶质瘤细胞U251细胞活性，提示Smad 4在胶质瘤中可以调节细胞增殖，虽然目前尚无Smad 4可以调节人脑胶质瘤细胞增殖的报道，但之前报道在胶质瘤中发现Smad 4异常表达，且可以调节胃癌细胞增殖［9］，因此Smad 4可能是调节胶质瘤增殖的一个重要基因。

众所周知，胶质瘤细胞的异常增殖是胶质瘤发生发展的重要机制，调节胶质瘤细胞增殖，可以提高患者的生存时间，本实验证实了Smad 4可以调节胶质瘤细胞增殖，其可能是胶质瘤治疗的新靶点，为胶质瘤治疗带来新的思路。

本实验发现，Smad 4可以降低TMZ化疗引起的U251细胞的凋亡，说明Smad 4可能与替莫唑胺化疗敏感性有关，虽然目前尚无Smad 4与TMZ化疗敏感性的相关的报道，但已有文献报道，Smad 4可以提高结肠直肠癌对洛莫司汀的化疗敏感性［10］。说明Smd 4可能是一个与化疗相关的蛋白。

Smad 4调节胶质瘤对替莫唑胺敏感性的机制尚不清楚。但最近研究发现，敲低Smad 4可以提高调节肿瘤细胞的凋亡［9，11］。众所周知，凋亡对于化疗敏感性非常关键［12］，Smad 4是一个与替TMZ化疗敏感性有关的蛋白。但目前胶质瘤化疗敏感性的机制尚不清楚，对化疗敏感性机制的研究可以为解决这一难题提供线索。

总之，本研究发现Smad 4可以提高胶质瘤细胞的增殖，可以降低胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性，Smad4可能是一个与胶质瘤细胞增殖与化疗敏感性相关的蛋白。

参考文献

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2 Zhang DT，Shi JG，Liu Y，et al，The prognostic value of Smad4 mRNA in patients with prostate cancer．Tumour Biol，2014，35 （4）：3333－3337．

3 Jiang W，Zheng Y，Huang Z，et al．Role of SMAD4in the mechanism of valproic acid＇s inhibitory effect on prostate cancer cell invasiveness．Int Urol Nephrol，2014，46（5）：941－946．

4 Liu NN，Xi Y，Callaghan MU，et al．SMAD4is a potential prognostic marker in human breast carcinomas．Tumour Biol，2014，35（1）：641－650．

5 陈谦学，邵步云，郑 虎，等．转化生长因子β及其信号转导分子Smad4，Smad7在人脑胶质瘤中的表达及其意义．中华实验外科杂志，2005，22（1）：90－95．

6 Xue J，Lin X，Chiu WT，et al．Sustained activation of SMAD3／SMAD4by FOXM1promotes TGF－beta－dependent cancer metastasis．J Clin Invest，2014，124（2）：564－579．

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9 Xiao B，Zhu ED，Li N，et al．Increased miR－146ain gastric cancer directly targets SMAD4and is involved in modulating cell proliferation and apoptosis．Oncol Rep，2012，27（2）：559－566．

10 Zhang B．，Chen X，Bae S，et al．Loss of Smad4in colorectal cancer induces resistance to 5－fluorouracil through activating Akt pathway．Br J Cancer，2014，110（4）：946－957．

11 Ke Z，Zhang X，Ma L，et al．Deleted in pancreatic carcinoma locus 4／Smad4participates in the regulation of apoptosis by affecting the Bcl－2／Bax balance in non－small cell lung cancer．Hum Pathol，2008，39（10）：1438－1445．

12 Burger MC，Brucker DP，Baumgarten P，et al．PAX2is an antiapoptotic molecule with deregulated expression in medulloblastoma．Int J Oncol，2012，41（1）：235－241．

（2015－02－16收稿）

作者单位：430060 武汉大学人民医院神经外科［刘宝辉 田道锋 王军民 李明昌 董慧敏 张申起 蔡 强 陈谦学（通信作者）］

Construction of plasmid of Smad4 and its expression and function in glioma cellsLiu Baohui，Tian Daofeng，Wang Junmin，et al．Department of Neurosurgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

【Abstract】Objective To construct the plasmid of Smad4and observe its expression and effect in U251 cells．Methods Plasmid of Smad4was constructed and transfected to U251cells by FUGENE HD．G418was used to kill the cells that transfected unsucessfully．Western blot and real time PCR（RT－PCR）were used to observe the expression of Smad4．Three groups were set，control group，N1group and Smad4group．CCK8assay was used to detect the proliferation of N1group and Smad4group and the proliferation of cells when TMZ was given．Results The plasmid PEGFP－Smad4and Smad4－U251cells were constructed．CCK8result showed that the relative proliferation of cells in Ctrl group，N1group and Smad4group was：1±0．03，0．95± 0．04，3．22±0．13respectively，and there was significant difference between Smad4group and N1group．The expression of pHistone H3was increased when Smad4was over expressed．Flow Cytometry result showed that the apoptosis of cells in Ctrl group，N1group and Smad4group was 0．36±0．09，0．38±0．11，0．21±0．03 respectively，when the cells was treated by TMZ，and the Casepase 3protein expression level decreased when Smad4was increased．Conclusions The plasmid PEGFP－Smad4is constructed successfully and the overexpression system is also established．Smad4can improve the proliferation of U251cells and decrease the chemosentivity

【Key words】Smad4 U251 Plasmid Proliferation Chemosentivity

基金项目：武汉大学人民医院国家自然科学基金孵育项目（2013RMFH014）；国家自然科学基金项目（81372683）；武汉大学新教师基金项目（274222）

【文章编号】1007－0478（2015）05－0288－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R739．4