谷胱甘肽修饰的SiO2 ＠Au 核壳填料的制备及其作为毛细管液相色谱和加压电色谱固定相的性能评价

汪 慧， 薛 芸， 鲁阳芳， 谷 雪， 王 彦 ， 阎 超

（上海交通大学药学院，上海200240）

近年来，随着代谢组学、食品药品科学、环境检测等领域对分离分析技术要求的不断提高，对作为液相色谱核心技术的色谱填料也提出了更高的要求。作为新一代的色谱填料，核壳填料凭借高比表面积和低传质阻力的特点，具有低反压、高柱效的独特优势，逐渐成为新型色谱填料领域研究的热点［1，2］。SiO2＠Au 核壳颗粒是一种贵金属核壳颗粒，它是由Au 壳包覆SiO2形成的特殊结构，具有很高的光学可调性及良好的生物相容性，在生物医学［3］、光学［4］等领域有着广泛的应用。在色谱领域，SiO2＠Au 核壳颗粒应用比较少。Qu 等［5］制备了SiO2＠Au-C18 反相型核壳填料，并利用加压毛细管电色谱证明该色谱填料不仅具有良好的分离能力，且pH 适用范围很广（pH ＝1 ～14），与传统硅胶基质的填料适用pH 范围（pH ＝2 ～8）相比，具有耐酸耐碱的优势，由此可见SiO2＠ Au 核壳颗粒在色谱领域有着广阔的应用前景。

由于Au 颗粒具有化学性质稳定、表面易键合等特点［6］，SiO2＠Au 核壳颗粒的表面可以进行各种衍生，根据键合基团种类的不同，可以制成不同性质的色谱填料。亲水性色谱填料是色谱填料中开发比较晚，但是发展较迅速的一种，它的出现为反相色谱填料做了一个很好的补充，且在分离极性化合物方面有着很大的优势［7，8］。亲水填料制备的固定相主要包括硅胶、整体柱和化学键合固定相。两性离子固定相作为化学键合固定相的一种，广泛应用于多肽、糖苷等极性物质的分离分析中［9］。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种含有两性离子的化合物，有研究表明，表面键合谷胱甘肽的填料具有亲水、离子交换等复杂的分离机理［10］，对强极性物质有很好的分离。目前，在SiO2＠ Au 核壳颗粒的表面键合谷胱甘肽的填料还未见报道。

制备SiO2＠Au 核壳颗粒最为常用的方法是自组装-化学镀法［11-13］，该方法最关键的步骤即为二氧化硅表面的氨基化。传统的二氧化硅表面修饰方法主要是用硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）或者3-氨丙基三甲氧基硅氧烷（3-aminopropyl trimethoxysilane，APTMS）在二氧化硅表面键合上氨基，但是由该种方法制备的SiO2＠Au 核壳材料的Au 的包覆量低，而且均匀性也比较差［14］。本文利用醛基与氨基的席夫碱反应，引入含高密度氨基的聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI），大大提高了SiO2表面的氨基量；并优化了制备SiO2＠Au 核壳填料的条件，改善了Au 纳米颗粒容易聚集的现象，制备了Au 覆盖率较高、较均匀的SiO2＠Au 核壳填料，并在SiO2＠Au 核壳填料的表面键合上谷胱甘肽，成功制备了填充了该种填料的毛细管柱，最后利用毛细管液相色谱（cLC）和加压毛细管电色谱（pCEC）对制备的毛细管柱的亲水性能进行了初步的研究和探索。

1 实验部分

1.1 仪器和耗材

甲醇、乙腈（色谱纯）；柠檬酸钠、正硅酸四乙酯、氯金酸、硫脲、咖啡因、茶碱、胸腺嘧啶、无水甲苯、甲醛、PEI（mean relative molecular mass （Mav）＝70 000）、APTES（纯度98%）、碳酸钾、戊二醛、GSH（上海国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（常熟市杨园化工有限公司）；氨水（平湖化工试剂厂）；水为二次蒸馏水。

扫描电子显微镜（scanning electronic microscope，SEM，Sirion 200，USA）；透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM，JEM 2010HT，Japan）；傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR，Nicolet Fourier，USA）；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，巩义市予华仪器责任有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定兰格恒流泵有限公司）；加压毛细管电色谱仪（TriSepTM-2100，上海通微分析技术有限公司）。

1.2 金溶胶的制备

本实验采用柠檬酸钠还原法［15］制备了稳定且粒径可控的金溶胶纳米颗粒，具体过程为：取0.01%（m／m）氯金酸水溶液100 mL，加热至沸腾后，加入1%（m／m）柠檬酸钠水溶液2 mL，继续加热反应使溶液依次呈现灰色-黑色-淡酒红色的颜色变化。将反应结束后的金溶胶置于4 ℃冰箱中保存，备用。取少量最终稳定的淡酒红色溶液，滴加至镀碳铜网上，烘干后进行透射电子显微镜表征。

1.3 单分散SiO2 微球的制备

本研究在改进的两相溶胶-凝胶法［16］的基础上制备了单分散的无孔二氧化硅微球，制备过程如下：取超纯水-无水乙醇-氨水（10 ∶3.1 ∶10，v／v／v）混合液6 mL，迅速加入正硅酸四乙酯2 mL，机械搅拌反应30 min 后，以1 ∶3 （v／v）的比例缓慢滴加适量的正硅酸四乙酯和超纯水-无水乙醇-氨水（10 ∶3.1 ∶10，v／v／v）混合液。滴加结束后进行陈化；陈化结束后离心，用乙醇洗涤所得固体，然后干燥备用。取少量所得固体分散至无水乙醇中，超声分散后滴加至铝箔上，烘干后进行扫描电子显微镜表征。

1.4 SiO2 微球表面修饰聚乙烯亚胺分子

本研究利用醛基和氨基之间的席夫碱反应在SiO2微球表面引入聚合物分子PEI，以提高微球表面的氨基含量。首先，利用硅烷化试剂的水解反应，将含有氨基的APTES 分子修饰到SiO2微球表面：取SiO2微球1 g，超声分散至100 mL 无水甲苯中，加入APTES 溶液，于120 ℃下反应24 h。反应结束后用甲苯、无水乙醚依次洗涤；然后，通过氨基与戊二醛之间的席夫碱反应，使SiO2微球表面含有醛基：将上述APTES 修饰的SiO2微球超声分散至冰乙酸-甲醇（298 ∶2，v／v）溶液中，加入3 mL 戊二醛，室温下磁力搅拌反应9 h。反应结束后抽滤，用甲醇洗涤除去多余的戊二醛，即得戊二醛修饰的SiO2微球。最后，利用SiO2微球表面醛基与聚乙烯亚胺分子之间的席夫碱反应，将聚乙烯亚胺分子接枝到SiO2微球表面：将上述戊二醛修饰的SiO2微球重新分散至冰乙酸-甲醇（298 ∶2，v／v）溶液中，加入1 g 聚乙烯亚胺，室温下磁力搅拌反应9 h。反应结束后抽滤，用甲醇清洗后，将所得固体置于60 ℃真空干燥箱中干燥，即得聚乙烯亚胺分子修饰的SiO2微球，标记为SiO2＠PEI70000。

1.5 SiO2＠Au 核壳微球的制备

本研究通过自组装-化学镀法制备了SiO2＠Au核壳微球，主要流程包括两个步骤：（1）SiO2微球表面Au 种子化。取0.03 g 上述SiO2＠PEI70000微球超声分散至超纯水中，用氨水调节反应溶液pH 值为8，再加入25 mL Au 溶胶，反应4 h，反应结束之后用纯水离心洗去多余的Au 溶胶，即得Au 种子化SiO2微球。（2）SiO2微球表面Au 壳层的形成。取2.5 mL 氯金酸溶液（6 mmol／L）溶解在124 mL 超纯水中，磁力搅拌反应40 min，置于4 ℃冰箱中过夜进行陈化，得金陈化液。将上述制得的Au 种子化SiO2微球分散至24 mL 上述陈化液中，磁力搅拌条件下迅速加入40 μL 的甲醛溶液，于25 ℃条件下反应9 h，反应结束之后用纯水离心洗去多余的陈化液和甲醛，得金纳米颗粒包覆的SiO2微球，标记为SiO2＠Au 核壳微球。

1.6 SiO2＠Au 核壳微球表面修饰GSH 分子

本研究利用巯基和金颗粒之间的特异配位作用，将含有巯基的GSH 分子修饰在SiO2＠ Au 表面，制备了一种新型的两性离子型亲水色谱填料SiO2＠Au-GSH。制备流程为：取SiO2＠Au 核壳微球约0.1 g，加入到40 mL 谷胱甘肽（20 mmol／L）水溶液中，加盐酸调节反应溶液至pH 为3。避光条件下磁力搅拌反应24 h。反应结束后，抽滤、水洗，置于60 ℃真空干燥箱中烘干备用。

1.7 SiO2＠Au-GSH 亲水色谱柱的制备与表征

采用高压匀浆法将上述制备得到的SiO2＠Au-GSH 色谱填料填充至熔融石英毛细管（100 μm i. d.）中，得到有效长度12 cm（总长40 cm）的毛细管色谱柱。烧制两端柱塞和窗口后，安装至加压毛细管电色谱系统中进行色谱表征。测试样品为0.1 mmol／L 的咖啡因、茶碱和胸腺嘧啶混合样品，流动相为不同比例的乙腈和20 mmol／L 磷酸盐缓冲液混合溶液。

2 结果与讨论

2.1 金溶胶的制备

本实验在改进的柠檬酸钠还原氯金酸的方法基础上制备了金溶胶。该方法成本低、设备简单、反应时间短且操作简便。图1 为优化条件下制备得到的粒径约20 nm 的金溶胶纳米粒子的透射电镜结果，表明通过该方法制备的纳米金溶胶粒子粒径均一、单分散、比表面积较大，适于用作核壳材料的壳层粒子。

图1 金溶胶纳米颗粒的透射电子显微镜图Fig.1 TEM image of nanometer gold particles

2.2 单分散SiO2 微球的制备

本研究利用改进的溶胶-凝胶方法制备了球形单分散的SiO2微球。图2 为采用该方法制备得到的SiO2微球的扫描电镜结果，该结果表明制备得到的SiO2微球表面光滑、球形均匀、单分散且粒径约1 μm，适合作为核微球制备μm 级核壳材料。

2.3 SiO2＠Au 核壳微球的制备

2.3.1 SiO2＠Au 核壳微球的制备原理

图2 二氧化硅微球的扫描电子显微镜图Fig.2 SEM image of micrometer SiO2

本研究通过自组装-化学镀法制备了SiO2＠Au核壳微球。如图3 所示，主要流程包括3 个步骤：（1）SiO2微球表面的修饰：在SiO2微球表面键合上氨基，使Au 颗粒能够吸附在SiO2微球的表面。（2）Au 种子化SiO2的形成：在已经被修饰的SiO2混悬液中加入Au 溶胶，使小粒径的Au 溶胶颗粒初步吸附在SiO2微球的表面。（3）Au 种子化SiO2的成长：先配制含有Au 离子的陈化液，然后用还原剂甲醛将陈化液中的Au 离子还原，被还原的Au 借助成核部位Au 种子不断生长，最终形成完整的Au 壳层。

2.3.2 SiO2＠Au 核壳微球的制备条件优化

本实验主要从Au 种子化SiO2的形成和Au 种子化SiO2的成长两个阶段进行条件优化。在SiO2微球表面Au 种子化阶段，重点考察了不同pH 值（分别为4、8、10）对SiO2微球表面Au 种子化的影响；在SiO2微球表面Au 壳层形成阶段，重点优化了不同甲醛溶液用量（分别为20、30、40 和50 μL）对SiO2微球表面Au 壳层形成的影响。

图3 SiO2＠Au 核壳微球的制备Fig.3 Preparation of SiO2＠Au core-shell particles

不同pH 值对SiO2微球表面Au 种子化的影响：不同的pH 条件可以影响SiO2微球表面和Au表面的静电吸附能力。过酸或者过碱条件下，Au 颗粒与SiO2微球表面的结合能力都会下降。由图4可以看出，在pH 分别为4 和10 条件下，SiO2表面Au 的键合量都很低；在pH 8 条件下，Au 的吸附量比较高，分布也比较均匀，进一步证明合适的pH 值有助于Au 颗粒在SiO2表面的吸附。所以本实验选择的反应pH 值为8。

甲醛溶液用量对SiO2微球表面Au 壳层形成的影响：甲醛的主要作用是还原金陈化液中的Au离子，被还原的Au 借助成核部位的Au 种子不断生长，最终在SiO2微球表面形成完整的Au 壳层。在一定量的金陈化液条件下，甲醛过多或过少都会对Au 壳层的形成有一定的影响。如图5a 和图5b 所示，甲醛溶液的加入量分别为20 μL 和30 μL，相对较少，这样会导致还原的Au 量不够，从而使得壳层Au 的密度不大。但是甲醛溶液太多，如图5d 所示，当甲醛加入量为50 μL 时，被还原的Au 量也会随之增多，这样会造成Au 团聚，使得Au 吸附很不均匀。从图5c 可以看出，在甲醛量为40 μL 条件下，形成的Au 壳层比较均匀，覆盖率也比较高。所以本实验选择的甲醛量为40 μL。

2.4 SiO2＠Au 核壳微球表面修饰GSH

图4 不同pH 条件下制备得到的Au 种子化SiO2 微球的扫描电子显微镜图Fig.4 SEM images of gold-seeded silica microspheres prepared at different pH values

图5 不同甲醛用量制备的SiO2＠Au 核壳填料的扫描电子显微镜图Fig.5 SEM images of SiO2＠Au microspheres prepared with different contents of formaldehyde

还原型谷胱甘肽极易受到外界环境影响而产生氧化型谷胱甘肽，有文献表明在偏酸性条件下谷胱甘肽的稳定性比较好，所以本实验考察了不同pH对谷胱甘肽在SiO2＠Au 核壳填料的Au 表面的吸附量的影响。图6 为不同pH 条件下制备得到的SiO2＠Au-GSH 核壳填料的FTIR 表征结果。与pH 2 和pH 4 条件下结果比较，pH 3 时制备得到的SiO2＠Au-GSH 核壳填料有明显的Si-O-Si 的伸缩振动峰（1 080 cm-1和795 cm-1）和-COOH 峰（3 400 cm-1）、C＝O 峰（1 720 cm-1）、-CH2峰（2 920 cm-1）、-NH2峰（3 300 ～3 400 cm-1），表明在pH 3 条件下还原型谷胱甘肽能够被成功地键合到SiO2＠Au 微球表面。

2.5 SiO2＠Au-GSH 亲水色谱柱的表征

类似于典型的硫代甜菜碱型和磷酸胆碱型两性离子亲水色谱功能单体，谷胱甘肽结构中同时含有带正电荷的氨基和带负电荷的羧基，且结构本身具有良好的亲水性，因此可以作为良好的两性离子亲水色谱功能单体，使色谱填料具有很高的亲水性和良好的分离选择性。图7 为不同有机溶剂含量条件下，该SiO2＠ Au-GSH 色谱柱对3 种强极性化合物——咖啡因、茶碱和胸腺嘧啶的保留情况。在不同的ACN 浓度下，3 种物质保留时间的重复性（RSD）小于1.5%。

图6 不同pH 条件下制备得到的SiO2＠Au-GSH核壳填料的FTIR 表征结果Fig.6 FTIR spectra of SiO2＠Au-GSH prepared at different pH values

由图7 可以看出，在高有机相比例（≥80%，v／v）流动相条件下，随着水相比例的减小，3 种强极性化合物的保留增强，且随着化合物分子极性的不断增强（咖啡因＜茶碱＜胸腺嘧啶），其保留时间也越长。这个结果表明该SiO2＠Au-GSH 色谱柱对强极性化合物具有良好的亲水色谱保留能力。但在有机相比例＜80% 条件下，却没有体现出亲水性能，可能在这一条件下存在更为复杂的分离机理。

图7 流动相中乙腈含量对咖啡因、茶碱、胸腺嘧啶保留时间的影响Fig.7 Effect of acetonitrile content in the mobile phase on the retention times of caffeine，theophylline and thymine

加压毛细管电色谱是在毛细管液相色谱和毛细管电泳的基础上发展起来的新型的分离分析技术，具有高柱效、高选择性、高分辨率和快速分离的独特优势。在亲水作用色谱体系中，流动相含有比例较高的有机溶剂，这与非水毛细管电泳的电泳介质有些类似。因此，我们将该亲水毛细管色谱柱应用于水含量很少（5% 水）的加压毛细管电色谱分离系统，并比较了在色谱柱进口端施加不同电压情况下3 种强极性化合物的分离情况。由图8可以看出，进口端施加负电压时，3 种带正电荷的强极性化合物在亲水色谱和电场的双重分离机理作用下能够得到很好的分离，体现了该SiO2＠Au-GSH 亲水色谱柱在非水加压毛细管电色谱系统中对强极性化合物分子的分离优势。

图8 不同电压下3 种碱性物质的分离色谱图Fig.8 Chromatograms of three alkaline components under different applied voltages

3 结论

本研究通过引入聚乙烯亚胺聚合物分子，建立了一种表面金覆盖率高的SiO2＠Au 核壳填料的制备方法；并利用金和巯基的特异配位作用，制备了一种新型的两性离子亲水作用SiO2＠Au-GSH 核壳色谱填料。加压毛细管电色谱表征结果显示，SiO2＠Au 色谱柱对强极性化合物具有很好的分离能力，为代谢组学、中药复杂有效成分的分离提取等提供了一种新的分离手段。

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