延边黄牛血液Exosome的提取和鉴定

李金辉，蔡锦顺，于龙政，娄安钢，朴明淑，关立增*(.延边檀君药业有限公司，吉林延吉3300;.延边大学农学院，吉林延吉3300)

延边黄牛是我国著名五大地方良种牛之一，也是我国宝贵的畜禽品种财富［1］。延边黄牛养殖业已成为延边朝鲜族自治州农村经济中的支柱产业，是农民增收致富的主要途径。延边黄牛也具有生产高档牛肉的品质特性，延边黄牛肉质细腻多汁，鲜美可口，其风味可与韩牛等媲美，其肉质明显优于其他品种牛，特别是不饱和脂肪酸含量明显高于其他品种牛，因此延边黄牛养殖业蕴含着广阔的市场前景和巨大的财富潜力［2］。但是，延边黄牛饲养中也存在生长周期长、出栏率低等弊端，其中延边黄牛的生长效率是影响延边黄牛养殖业发展的关键因素之一［3-4］。因此，如何提高延边黄牛的生长效率是加快延边黄牛产业快速发展的关键问题之一。

外胞体(Exosome)是由多种细胞分泌的一种含有多种成分的纳米级小囊泡并存在于不同的细胞和体液当中［5-6］。Exosome的组成成分复杂，含有多种活性成分，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类等［7］。细胞或组织不同，形成的Exosome具有不同的功能。Exosome主要包括参与细胞间通讯交流、免疫调节、信号传递、生长发育和分化等过程［8］。笔者从延边黄牛分离并鉴定了Exosome，旨在为进一步研究Exosome对延边黄牛生长轴调控的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Sigma6k-15超速冷冻离心机(美国 Sigma公司)、超高速冷冻离心机(美国Kemdro公司)、JEM-1230EX透射电镜(日本)、100 ku MWCO CentripIus离心超滤管(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 血浆外泌体样小体的分离。取延边黄牛全血置于50 ml离心管中，2 500 r/min离心5 min，取上清获得血浆。取血浆于另一个50 ml离心管中，4 000 r/min离心10 min。离心后取上清于另1个50 ml离心管中，12 000 r/min离心40 min。离心后取上清置于超速离心管中，放入超速离心机中，50 000 r/m离心1 h。离心后，弃上清，用0.01 mol/L PBS将沉淀吹下，吸入EP管中，使用移液器反复吹打，使其溶解。再次将溶液于超速离心管中，放入超速离心机中，50 000 r/min离心1 h。离心后弃上清，吸入小离中，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器将沉淀反复吹打，使其完全混匀即为Exosomes溶液。于4℃下短期保存，-20℃下长期保存。

1.2.2 Exosome 的形态观察。取 25 μl Exosome 溶液滴于载样铜网上，室温静置1 min。用干净滤纸从侧面吸干液体，滴加30 μl 3%磷钨酸溶液(pH 6.8)于铜网上，室温环境下负染3 min。用滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约l0 min，置于透射电镜下观察并拍照。

1.2.3 Exosome的蛋白定量。采用Lorry法进行蛋白质定量［9］。

2 结果与分析

2.1 Exosome的电镜观察 获得的延边黄牛血浆经过一系列离心和超离心后得到Exosome，所得Exosome经负染在透射电镜下观察其形态为圆形或椭圆形双层膜小囊泡，且中间的密度要低于边缘，在边缘处有脂质双层膜结构，整个Exosome的直径为30～100 nm，膜结构完整(图1)。

2.2 Exosome的蛋白定量 延边黄牛血液中的Exosome内的蛋白浓度约为2 mg/ml，说明Exosome中存在着大量的蛋白质。

3 结论与讨论

延边黄牛的生长效率是影响延边黄牛养殖业发展的关键因素之一。因此，如何提高延边黄牛的生长效率是人们关注的主要焦点。外胞体(Exosome)是由多种细胞分泌的一种含有多种成分的纳米级小囊泡并存在于不同的细胞和体液中。Exosome的组成成分复杂，含有多种活性成分，如蛋白质、mRNA、miRNA和脂类等，可能参与细胞间通讯交流、免疫调节、信号传递、生长发育和分化等过程［7-8］。细胞分泌的Exosome可以分泌到体液(如血浆)中，因此从血浆中可以获得Exosomes［5-6］。然而，延边黄牛血液中的Exosome的结构特点及其对延边黄牛生长发育的影响的研究尚未见报道。笔者利用超速离心法从延边黄牛血液中分离到Exosome，并进行了电镜观察和蛋白定量，为进一步研究Exosome对延边黄牛生长影响的研究奠定了基础。

目前，Exosome的提取方法主要有超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤和试剂盒等方法［10］。该试验中主要采用超速离心分离Exosome，虽然该方法有耗时耗力、处理的样品数少等缺点，但采用该方法能制备出干净的Exosome，因此该试验中采用超速离心分离Exosome。

目前，鉴定Exosome主要采用电镜和Western blotting等方法。电镜法直观可靠，既可以观察到Exosome的结构，也可以测量其大小，是鉴定Exosome的首选方法［11］。笔者通过电镜技术对延边黄牛血液来源的Exosom进行超微形态学观察，从电镜负染观察可以看出，与其他来源的Exosome均为圆形或椭圆形双层膜小囊泡，这与其他文献内描述的外胞体形态一致［12］。通过蛋白定量结果表明，Exosome中存在一定浓度的蛋白质。

电镜和蛋白定量结果表明，使用超速离心方法能成功从延边黄牛血液中分离到Exosome，从而为进一步研究Exosome对延边黄牛生长轴调控的分子机制提供理论和工作基础。

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