2种组培方式草莓的扩繁效果及光合特性

柳燕　刘刃　竺锡武

摘要：比较分析固体培养基组织培养方式与生物反应器培养方式下草莓组培扩繁效果及其穴盘苗的光合特性。采用LC Pro+型便携式光合系统测定2种组培方式获得的组培穴盘苗的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（E）、叶胞间CO2浓度（Ci）。结果显示，在个体生物量和种苗增殖系数方面，红颊草莓快速扩繁采用生物反应器培养方式极显著优于固体培养基组培方式；在光合速率、气孔导度和呼吸效率方面，生物反应器培养方式的组培穴盘苗显著优于固体培养基培养方式的组培穴盘苗；在胞间CO2浓度（Ci）方面，生物反应器培养方式的组培穴盘苗与固体培养基培养方式的组培穴盘苗差异不显著。

关键词：组培方式；草莓；组织培养；扩繁效果；光合特性

中图分类号：S668.404 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0213-03

植物组织培养主要有利用固体培养基和液体培养基进行组织培养扩繁2种方式，其中利用固体培养基进行组织培养是传统的组培方式，在草莓组织培养已有较多的研究[1-5]；利用液体培养基进行组织培养主要指采用生物反应器盛装液体培养基通过瞬时浸没外植体方式培养获得植物组培苗（简称生物反应器培养或反应器培养），国外自20世纪80年代就已经开始发展[6-12]，而我国国内起步较晚[13-15]，生物反应器组培扩繁草莓苗方面的研究尚未见报道。固体培养基组织培养方式与生物反应器组织培养方式的比较在一些种类植物的外植体扩繁倍数、组培苗生长形态、鲜质量等方面都进行过研究[16-18]，但这2种组培方式培养的组培苗在光合特性方面有无差别国内外很少报道；而光合特性对组培苗的存活、壮苗有重要影响，已开始引起重视[19-20]。因此，本试验开展了2种草莓组培方式组培扩繁效果与穴盘苗光合特性的比较研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红颊草莓植株由笔者所在的实验室保存。

1.2 组培方法

（1）固体培养基组织培养法。按刘刃等的方法[5]进行。（2）生物反应器组织培养法。按开合式间歇浸没植物生物反应器（浙江理工大学生物工程研究所，专利号为2010202088879.1）[13]操作进行。红颊草莓的生物反应器培养主要参数设定：装液量1 000 mL；浸没频率10 min/4 h；通气量15 L/min；培养时间50 d；培养液更换频率25 d/次；接种密度40个/L。

1.3 光合特性的测定

将通过2种培养方式得到的红颊草莓组培苗经过穴盘（50孔穴盘，52 cm×26 cm）炼苗30 d后，移至日光温室内对其功能叶片的光合速率进行测定。数据测量期间，2组组培穴盘苗均移至日光温室，基质含水量维持在60%。光合测定条件：外界气温在18～25 ℃之间，分别取生物反应器培养和固体培养的红颊草莓各5株，要求草莓组培穴盘苗具有8～10根叶柄、生长旺盛、3出复叶完全展开等特点。选定每株草莓第3张新生叶。

测量前将50孔组培穴盘苗移至室外，令其在自然光下适应1 h，以促使叶片气孔打开，测量在隔日10：00开始进行。设定LC Pro+型便携式光合系统（ADC，England）的测量条件为：光合有效辐射（PAR）800 μmol/（m2·s），CO2供给浓度（350±2） μmol/mol，叶室温度（25±1） ℃，相对湿度（65±2）%。在此条件下对组培穴盘苗叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（E）、胞间CO2浓度（Ci）进行测量。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel 2013、SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 2种组培方式下草莓组培扩繁结果比较

在2种组培方式下培养的组培苗平均鲜质量（g）和外植体增殖系数见表1，在生物反应器培养下的外植体增殖系数可达到6.98，比对照组固体培养法的增殖系数（6.03）高158%，且差异极显著；生物反应器培养获得的组培苗平均鲜质量为4.14 g，是对照组固体培养（2.31 g）的1.79倍，且差异极显著，说明单位时间内相同数量的草莓外植体使用生物反应器培养可获得更多的种苗数量，提高扩繁效率。从生物量和种苗增殖系数可以发现，红颊草莓快速扩繁采用生物反应器培养方式极显著优于固体培养基组培方式。

2.2 2种组培方式的组培穴盘苗净光合速率

从图1可以看出，在培养后1、3、5、7 d，生物反应器培养的组培穴盘苗的净光合速率显著高于传统固体培养的组培穴盘苗；在培养后7、9 d，虽然两者之间差异不显著，但生物反应器培养的组培穴盘苗的净光合速率仍高于传统固体培养的组培穴盘苗。总体来说，2种组培方式得到的红颊草莓苗的光合速率在移栽初期差异显著，随着在日光温室中随着培养时间的延长，两者之间的差异有逐渐缩小的趋势。

2.3 2 种组培方式下组培穴盘苗的气孔导度

从图2可以看出，通过间歇浸没式生物反应器得到的草莓组培穴盘苗叶片在培养后1 d的气孔导度为

0.441 mmol/（m2·s），传统固体培养的苗的气孔导度为0.362 mmol/（m2·s），两者之间差异显著。培养后1、3、5、7 d，生物反应器组培穴盘苗与传统固体培养的组培穴盘苗的气孔导度差异显著；在培养后7 d，生物反应器的组培穴盘苗在气孔导度上与传统固体组培穴盘苗之间差异不显著，但整个测量过程中生物反应器组培穴盘苗气孔导度均高于传统固体组培穴盘苗。

2.4 2种组培方式下组培穴盘苗的蒸腾速率

从图3可以看出，在培养后1、3、5、7 d，生物反应器组培穴盘苗的蒸腾速率均高于传统固体组培穴盘苗。2种组培穴盘苗的蒸腾速率差值在培养后5 d达到最大，生物反应器组培穴盘苗为5.771 mmol/（m2·s），传统固体培养的组培穴盘苗为4.879 mmol/（m2·s）；在培养后1、3、5、7 d，生物反应器培养的组培穴盘苗与传统固体培养的组培穴盘苗的蒸腾速率差异显著；在培养后7 d，生物反应器培养的组培穴盘苗蒸腾速率与传统固体培养的组培穴盘苗之间差异不显著。endprint

2.5 2种组培方式下组培穴盘苗的胞间CO2浓度

从图4可以看出，生物反应器培养的组培穴盘苗的胞间CO2浓度均低于传统固体培养的组培穴盘苗，在培养后9 d时的差值最大，生物反应器组培穴盘苗的Ci值为313.9 μmol/mol，传统固体组培穴盘苗的Ci值为323.3 μmol/mol。在培养后1、3、5、7、9 d，2种不同培养方式得到的组培穴盘苗差异均不显著。

3 结论与讨论

本研究比较分析了生物反应器培养方式与传统固体培养方式下红颊草莓组培扩繁效果及其穴盘苗的光合特性。结果发现，红颊草莓组培扩繁采用生物反应器培养方式优于固体培养基培养方式。生物反应器组培扩繁效果优于固体培养基组培扩繁效果，在其他一些植物种类的组培研究中已有一些报道[13-15，17]。本研究结果证明，利用生物反应器组培扩繁草莓也是可行的，并具有显著优势。

笔者发现，在组培苗的光合性能方面，生物反应器培养的草莓组培穴盘苗优于传统的固体培养的组培穴盘苗。生物反应器培养的组培穴盘苗的净光合速率、气孔导度和呼吸效率显著优于固体培养基培养的组培穴盘苗。结果表明，组织培养方法影响了苗的光合特性。本研究结果与Zhao等的结果[14，19]是相似的，即在强力通风条件下的苗比对照苗有更大的净光合速率。Zhao等发现，强力通风能增强叶绿素含量[14]。笔者认为，强力通风可能是生物反应器培养方法培养的苗有更大的光合速率的原因。生物反应器培养的组培穴盘苗的气孔导度显著大于固体培养基的组培穴盘苗的气孔导度，这个结果与Zhao等的结果[14，21]是一致的。Majada等发现，叶中气孔的功能在通风条件下被改进[21]；Zhao等发现，强力通风能增强气孔密度[14]。生物反应器培养的组培穴盘苗呼吸效率显著大于固体培养基培养的组培穴盘苗，这个结果还没有被报道，有待进一步验证。生物反应器培养的组培穴盘苗的胞间CO2浓度均低于传统固体组培穴盘苗，但差异不显著，可能是因为生物反应器中组培苗相对较多，密度明显大于固体培养法组培瓶中组培苗密度。随着组培穴盘苗在自然环境下生长时间延长，2种培养方式得到的组培穴盘苗在净光合速率、气孔导度、蒸腾速率3个方面呈现出差异缩小的趋势，这可能与组培穴盘苗逐步适应自然环境条件有关。生物反应器培养的草莓穴盘苗在初期具有更好的净光合特性，能够更加快速地适应外部环境，从而增加穴盘苗幼苗期的存活率，更高的净光合速率也意味着更高的壮苗率，因此在商业化生产上具有较明显的优势。

参考文献：

[1]覃兰英，徐光霞，邓世秀.草莓茎尖离体培养大量繁殖研究初报[J]. 中国果树，1981（3）：38-40.

[2]郭亚华，于志明，邓立平，等. 草莓组织培养研究初报[J]. 生物技术，1991，1（3）：30-32.

[3]罗君琴，李 丽，林 俊，等. “红颊”草莓茎尖快繁技术研究[J]. 现代园艺，2008（11）：4-5.

[4]孙永平，高年春，张 琼，等. 红颊草莓组培快繁技术研究[J]. 江苏农业科学，2011，39（5）：63-64.

[5]刘 刃，吕 乐，竺锡武.红颊草莓组培标准化及穴盘壮苗研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（7）：34-37.

[6]Tisserat B，Vandercook C E. Development of an automated plant culture system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（2）：107-117.

[7]Simonton W，Robacker C，Krueger S. A programmable micropropagation apparatus using cycled liquid medium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1991，27（2）：211-218.

[8]Lorenzo J C，González B L，Escalona M，et al. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1998，54（3）：197-200.

[9]Alister B，Finnie J，Watt M P，et al. Use of the temporary immersion bioreactor system （RITA） for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests （SA）[J]. Liquid Culture Systems forin vitro Plant Propagation，2005，4：425-442.

[10]Berthouly M，Etienne H. Temporary immersion system：a new concept for use liquid medium in mass propagation[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：165-195.

[11]Hempfling T，Preil W. Application of a temporary immersion system in mass propagation of Phalaenopsis[J]. Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation，2005，2：231-242.endprint

[12]Roels S，Escalona M，Cejas I，et al. Optimization of plantain （Musa AAB） micropropagation by temporary immersion system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2005，82（1）：57-66.

[13]陈集双，张本厚，贾明良，等. 间歇浸没的开合式植物生物反应器：中国，2010202088879.1[P]. 2011-04-27.

[14]Zhao Y，Sun W，Wang Y，et al. Improved mass multiplication of Rhodiola crenulata shoots using temporary immersion bioreactor with forced ventilation[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166（6）：1480-1490.

[15]赵望锋，王力华.间歇浸没式生物反应器在大规模组织培养中的应用研究[J]. 安徽农业科学，2007，35（2）：317-320，323.

[16]Maene L，Debergh P. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，5（1）：23-33.

[17]贾明良.三叶半夏[Pinellia ternata （Thunb.） Breit.]组培标准化研究及生物反应器扩繁[D]. 杭州：浙江理工大学，2010.

[18]毕瑞明.不同培养方法对甘薯无菌苗生长的影响[J]. 生物技术，2002，12（2）：26-28.

[19]月 德，Desjardins Y，Gosselin A.草莓组培苗的光合能力与强制通气对其生长的影响[J]. 园艺学报，1993，20（2）：123-126.

[20]王必尊，唐粉玲，何应对，等. 不同基质对香蕉组培苗生长及光合特性的影响[J]. 热带作物学报，2013，34（3）：398-402.

[21]Majada J P，Centeno M L，Feito I，et al. Stomatal and cuticular traits on carnation tissue culture under different ventilation conditions[J]. Plant Growth Regulation，1998，25（2）：113-121.杨燕林，王朝文，杨洪涛，等. 不同土壤条件对蓝莓生长的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：216-217.endprint