婴幼儿脑干脑炎EV71-VP1、PSGL-1和SCARB2的表达

李明，孔小平，刘宏，程灵犀，黄京璐，权力，午方宇，郝博，刘超，罗斌

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.广州市公安局番禺区分局，广东广州 510180；3.广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030；4.广州市公安局南沙区分局，广东广州 510000）

婴幼儿脑干脑炎EV71-VP1、PSGL-1和SCARB2的表达

李明1，孔小平2，刘宏3，程灵犀4，黄京璐1，权力1，午方宇1，郝博1，刘超3，罗斌1

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.广州市公安局番禺区分局，广东广州 510180；3.广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030；4.广州市公安局南沙区分局，广东广州 510000）

目的观察人肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）、P选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）和人清道夫受体B2（scavenger receptor B2，SCARB2）在婴幼儿脑干脑炎的表达，探究PSGL-1、SCARB2与EV71间的联系及EV71感染人体后可能的侵染途径和机制。方法收集EV71-VP1染色阳性的10例婴幼儿的器官、组织进行PSGL-1、SCARB2免疫组织化学染色，并与EV71-VP1免疫组织化学染色结果相比较。结果EV71-VP1在脑内神经元、胶质细胞、血管周呈“袖套样”浸润的炎症细胞，胃底腺壁细胞呈强阳性；肺泡巨噬细胞，肠腺上皮细胞及黏膜层淋巴小结、腭扁桃体中淋巴细胞呈中度阳性；肠系膜淋巴结、脾的淋巴细胞中呈弱阳性。PSGL-1仅在胃底腺壁细胞，腭扁桃体隐窝鳞状上皮组织，肺泡巨噬细胞及各组织白细胞中表达。SCARB2除肠、脾组织外均有表达。结论SCARB2与EV71组织分布具有相关性，在病毒的侵染及复制过程中起重要作用。胃可能是EV71复制的一个重要部位。

法医病理学；脑炎；肠道病毒属；P-选择素糖蛋白配体1；清道夫受体，B类；婴幼儿

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起手足口病的主要病原体之一，多数病例预后良好，但少数病例伴有神经系统表现，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性迟缓性麻痹、神经源性肺水肿等，后果严重甚至导致死亡[1]。近年来，亚太地区发生过几起手足口病的大规模爆发。因少数EV71所致手足口病患儿入院症状轻微，但病情发展迅速，突然死亡而常引发严重的医患纠纷等社会问题，故成为法医及临床的研究热点之一。P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）和人清道夫受体B2（scavenger receptor B2，SCARB2）已被证实为EV71的两种特异性细胞受体。

本研究以EV71致脑干脑炎婴幼儿部分器官组织为对象，通过免疫组织化学方法检测PSGL-1、SCARB2及肠道病毒71型病毒蛋白1（enterovirus 71 virus protein-1，EV71-VP1）在器官组织中的表达分布情况，以求探讨EV71可能的侵染途径及机制，为EV71临床病理学和法医病理学研究提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

实验组：收集2013—2014年中山大学法医鉴定中心12例尸检确认为脑干脑炎死亡的婴幼儿（年龄7～48个月）的脑干组织，常规制HE切片，将小血管壁周炎症细胞呈“袖套样”浸润的切片进行EV71-VP1免疫组织化学染色，选择脑干组织EV71-VP1阳性的婴幼儿脑、肺、扁桃体、胃、肠、肠系膜淋巴结、脾组织为实验组。

对照组：收集2013—2014年中山大学法医鉴定中心8例婴幼儿猝死综合征、先天性心脏病死亡的婴儿（年龄12～36个月）相应器官作为对照组。

1.2 临床病例资料

实验组病历资料均较完整：一般以发热，体表、口腔及咽喉部炎性疱疹为主要首发症状，多数病例随着病情进展出现呕吐、气促、抽搐等症状，偶伴咳嗽。大部分婴幼儿被诊断为“上呼吸道感染”“胃肠炎”“婴幼儿肺炎”等，经抗感染、对症支持治疗后病情仍恶化，短时间内死亡（病程2～3d）；其中1例粪便样本经疾病预防控制中心检测，EV71核酸阳性。

1.3 试剂

兔抗人EV71-VP1多克隆抗体（0.2 mL）购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人PSGL-1单克隆抗体（1.0 mL）、鼠抗人SCARB2单克隆抗体（1.0 mL）均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，即用型SABC免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 HE染色

死婴均低温保存1～3d后进行系统尸体解剖，提取的脑（含脑干）、肺、扁桃体、胃、肠、肠系膜淋巴结和脾组织经10%甲醛溶液固定12～24h后，制成蜡块保存。取组织蜡块常规切片、HE染色并观察。

1.4.2 免疫组织化学染色

对实验组及对照组组织蜡块进行连续切片以进行EV71-VP1、PSGL-1、SCARB2免疫组织化学染色。

将对照组和实验组切片经3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，室温静置10 min；PBS溶液洗片3次，每次5min；以EDTA溶液行高压热修复法修复抗原10 min；PBS溶液洗片3次，每次5 min，滴加正常小牛血清，室温保湿孵育20 min；实验组和对照组分别滴加1∶150稀释的EV71-VP1抗体，4℃保湿孵育过夜；37℃复温45min，滴加辣根过氧化物标记的抗兔/鼠抗体，室温保湿孵育20min；PBS溶液洗片3次，每次5 min，滴加DAB显色溶液，显微镜下观察显色结果；终止反应后以苏木素复染1min，1%盐酸-乙醇分化，自来水中返蓝30min；烤箱中56℃烘干10min，二甲苯透明，中性树胶封片。按照上述步骤分别进行PSGL-1单克隆抗体（1∶100稀释）及SCARB2单克隆抗体（1∶100稀释）免疫组织化学染色。

1.4.3 结果判定

PSGL-1、SCARB2及EV71-VP1抗体免疫组织化学染色：细胞膜或胞质中见深棕黄色颗粒状为阳性。染色结果按以下标准进行描述：阴性（-）；弱阳性（+），染色弱，浅黄色，少量阳性细胞；中度阳性（++），棕黄色，较多阳性细胞；强阳性（+++），染色强，棕褐色，大量阳性细胞。

2 结果

2.1 HE染色

2.1.1 实验组

脑：脑水肿，神经元和血管周围间隙明显增宽；多发性增生的胶质细胞聚集形成胶质小结；神经元肿胀、变性，尼氏小体消失，核结构不清或消失，嗜神经细胞现象及卫星现象；小血管周围炎症细胞沿血管壁呈“袖套样”浸润，以单核、淋巴细胞为主。

肺：肺泡壁毛细血管及间质血管扩张、淤血。部分肺泡腔内充满红染无结构均质物。部分细支气管黏膜上皮脱落，周围淋巴结增生。肺实质内未见炎症细胞浸润。

胃、肠及阑尾：黏膜上皮部分脱落，黏膜下血管扩张、淤血，肌层及浆膜层未见异常。部分案例胃、肠黏膜层见少量淋巴细胞浸润。

扁桃体：淋巴滤泡增生，隐窝内未见中性粒细胞浸润，间质血管扩张、淤血。

脾：脾小体及髓质结构清晰，脾窦淤血。

2.1.2 对照组

各器官组织见非特异性病理改变。

2.2 免疫组织化学染色结果

2.2.1 EV71-VP1免疫组织化学染色

实验组中有10例EV71-VP1抗体免疫组织化学染色阳性，判断为EV71感染阳性；另外2例判断为其他病毒感染所致脑干脑炎。在所有10例脑内神经元（图1A）、胶质细胞、血管周呈“袖套样”浸润的炎症细胞（图1B）及胃底腺的壁细胞EV71-VP1染色呈强阳性；在6例肺泡巨噬细胞、4例肠腺上皮细胞及黏膜层淋巴小结中淋巴细胞（图1C），3例腭扁桃体淋巴、巨噬细胞（图1D）中呈中度阳性；在5例肠系膜淋巴结（图1E），4例脾淋巴细胞（图1F）也能检见EV71抗原，但呈弱阳性（仅少数细胞）；在肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮细胞呈阴性。

对照组组织均未见阳性细胞。

2.2.2 PSGL-1免疫组织化学染色

实验组中胃黏膜层胃底腺的壁细胞（图2A）、腭扁桃体隐窝鳞状上皮细胞（图2B）、肺泡腔巨噬细胞（图2C）中PSGL-1染色呈弱阳性，而在其他组织中呈阴性，此外各组织白细胞呈中度阳性。对照组与实验组并无明显差别。

图1 EV71-VP1免疫组织化学染色SABC×200

图2 PSGL-1免疫组织化学染色（SABC法）

2.2.3 SCARB2免疫组织化学染色

实验组中脑组织的神经元（图3A）、小胶质细胞及血管周呈“袖套样”浸润的炎症细胞（图3B）、胃底腺的壁细胞（图3C）SCARB2染色呈强阳性；肺泡腔巨噬细胞（图3D）、腭扁桃体隐窝鳞状上皮细胞（图3E）呈中度阳性；支气管黏膜上皮细胞（图3F）、肠系膜淋巴结中淋巴细胞（图3G）呈弱阳性；而肺泡上皮细胞、肠、脾组织中呈阴性。

除脑组织、胃底腺外，其他组织SCARB2表达量较低，且并不是在同类型的所有细胞中均有表达。与对照组比对，两组之间受体表达与分布并无差别，但在胃底腺两组之间存在差别（图3C、3H）。

图3 SCARB2免疫组织化学染色（SABC法）

2.2.4 EV71-VP1、PSGL-1及SCARB2三者相互关系

10 例脑、肺、胃、肠EV71-VP1、PSGL-1及SCARB2免疫组织化学染色结果进行对比。脑、肺、胃、肠结果显示：病毒抗原EV71-VP1分布的细胞几乎都有SCARB2的表达，PSGL-1则不然。

3 讨论

研究[2]证实，EV71是一种高度嗜神经病毒，脑干最易被感染。EV71致死者中枢神经系统的损害形式较为固定，表现为脑实质内小胶质细胞弥漫或结节状增生，伴少量淋巴细胞浸润；神经元尼氏小体消失，核结构不清或消失，轴突不明显，嗜神经现象；小血管壁周炎症细胞呈“袖套样”浸润。呼吸系统主要表现为肺水肿、肺出血，未见肺透明膜形成，无弥漫性肺泡损伤改变。消化系统除见肠系膜淋巴结增大、肠淋巴结增生外也未见明显的病理改变[3-4]。但Zhang等[5]将EV71经呼吸道、静脉途径感染恒河猴后，却发现肺泡结构损伤，终末支气管和小支气管周围大量炎症细胞浸润。Yang等[6]在手足口病严重的患者观察到肠道组织发生明显的病理变化，如肠坏死、肠壁变薄、肠黏膜充血、黏膜下淋巴滤泡增生等。本研究实验组死婴均经系统尸体解剖后认定为脑干脑炎导致中枢神经系统功能障碍死亡，各组织病理变化与以上基本相符，但支气管未观察到明显的病理改变，肠黏膜仅观察到部分脱落，未见肠黏膜坏死，部分案例胃黏膜中见较少炎症细胞浸润。

VP1是EV71最具研究价值的结构蛋白。许多学者对EV71感染机体后病毒的分布进行了研究，Zhang 等[7]对手足口病暴发期间1例死者进行了研究，发现在其支气管上皮细胞可检测到EV71抗原，而在肺泡细胞中则检测不到。Zhang等[5]利用恒河猴进行动物实验，发现在中枢神经系统、肺及支气管组织均检出大量的EV71抗原，而在肠道组织中仅观察到少量的抗原表达，认为EV71易感染呼吸道组织。相反，小鼠和猕猴实验均表明EV71不在除中枢神经系统以外的组织中进行复制[8-9]。He等[10]对7例EV71所致脑脊髓炎死婴中枢神经系统及非中枢神经系统组织中EV71抗原进行了检测，发现除中枢神经系统、腭扁桃体外，其他组织如食管、胃、大肠、胰腺、肺泡、支气管等均未检测到EV71抗原。本研究对各组织中EV71-VP1抗原的分布进行了检测，发现脑组织中神经元、胶质细胞、血管周呈“袖套样”浸润的炎症细胞，胃底腺壁细胞EV71-VP1免疫组织化学染色呈强阳性；肺泡巨噬细胞，肠腺上皮细胞及黏膜层淋巴小结、腭扁桃体的淋巴细胞中呈中度阳性；肠系膜淋巴结、脾淋巴细胞中呈弱阳性，而肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮细胞阴性。这与以往研究有差异，可能与物种、病毒毒株、取材部位、样本量、疾病发展阶段（组织来源的案例死者已处于疾病终末期）等不同有关。以上结果显示病毒的感染与组织炎症部位基本一致，上述组织的病理学改变可能为病毒直接导致或由其引发的免疫反应所致，也印证了死者肺水肿是神经源性的，与系统性炎症反应有关。此外病毒抗原在胃底腺壁细胞中呈强阳性表达也提示胃可能是EV71复制的一个重要部位。

病毒受体决定了病毒宿主范围及侵染组织特异性，PSGL-1和SCARB2是EV71的功能性受体[11-12]，为了进一步了解其相互关系，本研究对这两种受体的组织分布进行了检测。发现病毒抗原分布与SCARB2的分布有很好的相关性，病毒抗原分布的细胞几乎都有SCARB2的表达，PSGL-1则不然。有研究[13]认为，细胞SCARB2表达水平与病毒敏感性及感染率有关，EV71在细胞中进行复制时需要依靠SCARB2进行脱衣壳，而PSGL-1并不具有此功能，且某些EV71毒株并不利用PSGL-1作为主要功能性受体，即使PSGL-1受体对EV71的亲和力强于SCARB2[14]。也有研究[15]认为EV71与PSGL-1受体的结合有可能使病毒逃避宿主的免疫攻击，进而导致免疫系统对此病毒的耐受，且有学者[13]认为在通过粪口途径进行传播时，EV71病毒首先通过位于口腔或食道上的PSGL-1受体被吸收，进而通过位于白细胞和巨噬细胞上的PSGL-1受体传播到全身。本研究认为SCARB2在病毒的侵染及复制过程中起更重要的作用，PSGL-1可能在病毒血症期间病毒传播及通过血脑屏障起一定的作用。

有学者通过小鼠实验认为EV71主要通过逆轴突运输侵染中枢神经系统，而经血运途径并非侵染中枢神经系统的主要途径[9]。郝博等[16]认为EV71更倾向于通过与星形胶质细胞形成的脚板结合，进而透过血脑屏障到达神经中枢。也有研究[17-18]证明组成血脑屏障的血管内皮细胞、星形胶质细胞在EV71侵染中枢神经系统过程中起一定的作用。根据死婴生前临床表现，结合本次实验结果对EV71的侵染途径进行推测：首先通过口腔进入人体，通过与受体结合在口咽部的淋巴组织（扁桃体）和消化道中进行复制（主要是胃，所取肠黏膜及肠系膜淋巴结仅检出少量病毒抗原，且多数患儿并无腹泻症状，加之本次研究对象均处于疾病终末期），引起病毒血症，期间EV71可通过PSGL-1与炎症细胞结合，并可以在具有SCARB2的炎症细胞中进行复制，随血液流动侵犯脑、脊髓和皮肤等靶器官，也可能通过感染肌肉组织进而通过逆轴突运输途径侵染中枢神经系统。

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Expression of EV71-VP1,PSGL-1 and SCARB2 in Tissues of Infants with Brain Stem Encephalitis

LI Ming1,KONG Xiao-ping2,LIU Hong3,CHENG Ling-xi4,HUANG Jing-lu1,QUAN Li1,WU Fang-yu1, HAO Bo1,LIU Chao3,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;2.Fanyu Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510180,China;3.Institute of Guangzhou Criminal Science and Technology,Guangzhou 510030,China;4.Nansha Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510000,China）

Objective To understand the correlation of enterovirus 71（EV71）,P-selectin glycoprotein ligand-1（PSGL-1）,and scavenger receptor B2（SCARB2）and to explore the possible pathway and mechanism of EV71 infection by observing the expression of EV71,PSGL-1 and SCARB2 in tissues of infants with brain stem encephalitis.Methods The organs and tissues of infants with EV71-VP1 positivity in their brain stems were chosen.Expression and distribution of EV71-VP1,PSGL-1,and SCARB2 were detected and compared by immunohistochemistry.Results Strong staining of EV71-VP1 was observed in the neuron,glial cells,the inflammatory cells of perivascular cuffing,parietal cells of the gastric fundus gland while alveolar macrophages,intestinal gland epithelium cells,mucosa lymphoid nodule and lymphocyte of palatine tonsil showed moderate staining and weak staining were displayed in mesenteric lymph nodes and lymphocyte of spleen.PSGL-1 expression was detected in parietal cells of the gastric fundus gland,tonsillar crypt squamous epithelium,alveolar macrophages and leukocytes in each tissue.SCARB2 expression was observed in all the above tissues except the intestines and spleen.Conclusion The distribution of EV71 correlates with SCARB2 expression.SCARB2 plays an important role in virus infection and replication.Stomach may be an important site for EV71 replication.

forensic pathology;encephalitis;enterovirus;P-selectin glycoprotein ligand-1;scavenger receptors,class B;infants

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.005

1004-5619（2015）05-0097-05

2014-10-13）

（本文编辑：刘宁国）

国家自然科学基金资助项目（39700167）；“十二五”国家重大科技攻关项目（2012BAK02B002）；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（2013KF1307）

李明（1988—），男，山西长治人，硕士研究生，主要从事心源性猝死病理学研究；E-mail：1656201438＠qq.com

罗斌，男，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事心源性猝死、过敏性休克的病理学研究；E-mail：luobin＠mail.sysu.edu.cn