小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较

张雨欣　高秋　逄洪波　赵佳欣　秦源源　姚丽梅　魏继莹

摘要：为了得到经济、简便、易于操作且效果好的基因组DNA，选取小白鼠6种不同的组织部位：肝、脾、肾、尾、肺和心脏，分别采用SDS法和CTAB法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和PCR3种手段对其质量和浓度进行检测，结果显示：小白鼠6种组织部位采用SDS和CTAB法提取的基因组DNA均可扩增得到目的基因，满足下一步分子生物学试验的要求。但是从DNA的质量和产量方面，不同组织部位之间具有很大差别，CTAB法和SDS法针对不同的组织部位具有不同的优势。总体来看，在小鼠的6种组织部位中，肝脏最适合用来提取基因组DNA。

关键词：SDS法；CTAB法；基因组DNA；DNA提取；小白鼠；组织器官

中图分类号： Q523 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0047-03

DNA是生物体的基本遗传物质。基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作[1]，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。因此，学习、掌握DNA提取方法并对其进行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法[2-7]，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法进行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法[8-15]。目前，传统的SDS法和CTAB法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多[16-19]。基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2 试剂 dNTP、DNA Marker、高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物于Invitrogen 北京分公司合成，CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 SDS提取法 参照中真核基因组DNA提取方法[方案5][1]从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA并作适当修改。此流程最初由Palmiter等[20]提出，现在关于动物基因组提取的很多方法都是由此衍生而来的。其具体步骤如下：

样品预处理：解剖小鼠，PBS磷酸缓冲液冲洗各组织部位后，将组织尽量剪碎后分别放入冻存管，液氮速冻后，保存于-70 ℃。其中尾巴部位剪成1 cm左右小段。取小鼠不同部位组织至灭菌研钵中，液氮研磨。研磨好的样品放入到灭菌离心管中，为了便于试验结果的比较，将研碎的组织均加入到离心管500 μL刻度处。加入500 μL SNET裂解缓冲液，再加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）使终浓度达到400 μg/mL，充分混匀后，60 ℃保温1.5 h。待冷却至室温时加入等体积氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），上下温柔翻转5 min；12 000 r/min，室温离心10 min，取上清液转移到新的1.5 mL离心管中。加入2.5 μL RNaseA（10 μg/μL），37 ℃保温30 min除去其中的RNA。加入等体积氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），上下温柔翻转5 min；12 000 r/min，离心10 min，取上清液到1个新的1.5 mL离心管中，重复此操作1次。加入2/3倍体积异丙醇，-20 ℃静置10 min，沉淀DNA。4 ℃，12 000 r/min离心 10 min 收集沉淀的DNA。用70%的乙醇清洗沉淀，4 ℃12 000 r/min 离心5 min，去上清。用冷冻的无水乙醇清洗沉淀。4 ℃ 12 000 r/min离心7 min，去上清。室温干燥DNA。加入20 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 CTAB提取法 参照Doyle等的方法[3]，并进行适当修改。试验流程绝大部分与SDS法相同，只在划线处存在变动。划线处试验步骤改为：将研磨好的样品，加入预热好的4×CTAB提取液500 μL，同时加入10 μL的β-巯基乙醇。

1.2.3 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 2种方法提取不同组织部位的基因组DNA，每个样品吸取1 μL原液，选择λ-HindⅢ 作为DNA marker，0.8%琼脂糖凝胶电泳，120 V，30 min，EB染色后，凝胶成像仪（中国北京宾达英创科技有限公司，202D型）拍照保存。

1.2.4 基因组DNA质量和浓度测定 使用超微量分光光度计NanoDrop 2000（Thermo）检测DNA 的纯度及浓度，分别测定基因组DNA 在D260 nm 和D280 nm 的吸光度，以及D260 nm/D280 nm 和D260 nm/D230 nm比值。同时，测定提取的基因组DNA 的浓度。

1.2.5 PCR扩增 使用小鼠看家基因引物[21]Actin F（5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′）和Actin R （5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′） 进行扩增，目的片段长411 bp。试验采用20 μL体系，成分如下：13.7 μL ddH2O；2.0 μL 10×PCR Ex buffer；2.0 μL dNTP （2.5 mmol/L each）；0.8 μL Actin F（5 mmol/L）；0.8 μL Actin R （5 mmol/L）；0.5 μL DNA模板。提取的12个基因组DNA样品，根据浓度将其稀释成不同倍数，达到终浓度大约为8 ng/μL，用作PCR模板。PCR程序设为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL扩增产物，0.8% 琼脂糖电泳检测目的基因扩增情况。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

SDS法和CTAB法提取6个组织部位基因组DNA，每个部位每种方法任选1个作为代表，吸取1 μL原液，同时吸取3 μL DNA marker进行琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示，12个点样孔跑出的电泳条带，除了肾/SDS、心/SDS和心/CTAB条带较暗外，其余9个样品条带较亮、无拖尾；与λ-HindⅢ相比较，所有样品DNA大小均在10 kb左右（如图2左侧箭头所示），说明提取的基因组DNA完整性较好。但是几个浓度大的样品，点样孔存在不同程度EB吸收，并且在基因组DNA条带后方、靠近点样孔一侧有明亮度不同的条带，浓度低的样品则没有，而将浓度高的DNA样品进行稀释后，重新进行琼脂糖凝胶电泳，这一现象消失。因此推测此种现象很可能是由于DNA浓度过大造成的。脾/CTAB法提取的基因组DNA中的RNA条带较为明显。

2.2 紫外分光光度计检测DNA质量和浓度

采用紫外分光光度法测定提取的基因组DNA的纯度和浓度，D260 nm/D280 nm比值用来衡量蛋白质的去除情况，D260 nm/D230 nm比值用来衡量盐分去除情况，结果如表1所示。2种方法提取6种不同组织部位的基因组DNA，浓度和质量方面有很大差异。

在DNA浓度方面，SDS法提取6个组织部位的基因组DNA中，肝脏浓度最高，达到了（7 053.60±48.00）ng/μL；心脏最低，平均值只有13.32 ng/μL，两者浓度相差了500多倍；其余几个部位的浓度，从高到低依次为肺>脾>尾>肾。采用CTAB法提取的6个组织部位的基因组DNA，DNA浓度的数值也是肝脏最大（2 871.10±67.18）ng/μL，心脏最低（8.27±0.35）ng/μL，这点与SDS法相同，但是所获得的基因组DNA浓度均低于SDS法。其余4个部位的DNA浓度，从高到低依次为脾>肾>尾>肺。

在提取的DNA质量方面，主要根据D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值来衡量。D260 nm/D280 nm的比值可以看出基因组DNA中蛋白质和RNA的去除情况。纯净DNA的D260 nm/D280 nm比值应为1.8，如果小于1.6说明有蛋白质、酚等污染，如果大于1.9，证明RNA去除不完全。

从表1可以看出，肾/SDS纯度最差，平均值只有1.47；其次是心/SDS和心/CTAB，分别是1.71和1.68；脾/CTAB比值是2.05；而其余几个样品提取的基因组DNA质量较好，范围在1.73～1.86之间。D260 nm/D230 nm的比值可以检测出基因组DNA中盐分的去除情况，如果DNA盐分去除完全，D260 nm/D230 nm的比值应该在2.0以上。提取的所有样本，除了肺/SDS、尾/SDS、脾/SDS、脾/CTAB和肝/CTAB这5个样品的值接近于2.0（在1.93～2.06之间）之外，剩下的7个样品的盐分都没有去除完全（0.78～1.73），特别是其中的肾/SDS，比值只有0.78。

2.3 PCR检测

将2种方法6种不同组织部位提取的基因组DNA样品进行PCR扩增，吸取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。由图2可见，以0.5 μL DNA作为模板进行PCR扩增，1～12号点样孔均出现明亮、特异的条带，条带大小400多bp，符合目的片段的长度。同时阴性对照无任何条带出现，证明在整个PCR扩增过程中没有污染。

3 讨论

小白鼠是高校常用的一种试验动物，其组织部位由于其细胞类型、代谢产物等成分的不同，对不同的提取方法适用性也不一样。并且由于含有的一些特殊物质，导致在基因组DNA提取过程中，操作的难易度也不一样。试验共选取了6个组织部位，肝、脾、肾、尾、肺和心脏，尽管对样品进行了预处理（尽量将组织减碎），但是在研磨的难易度上，不同组织部位，差别很大。最容易研磨的部位是肝脏，并且肝脏的样品量最大，得率也最高；最不容易研磨的部位是尾巴，但是尾部除去漂浮的毛后，含的杂质最少，上清液最为清晰，后面的试验操作最为容易。而脾、肺、心的上清液都比较黏稠，后面较难操作。

为了节省时间，提高试验效率，将细胞裂解、释放基因组DNA的时间进行了改良，即水浴时间缩短到1.5 h。同时为了便于比较2种方法的优劣，水浴的温度都定在了60 ℃，观察紫外分光光度计的检测结果，可以看出，除了肾/S、心/S和心/CTAB外，大部分样品的蛋白都去除得比较彻底。

SDS法提取6个组织部位得到的基因组DNA，D260 nm/D230 nm的比值普遍都低于2.0，说明SDS法提取基因组DNA时，去盐不完全，但是从PCR结果来看，可以扩增出目的基因，说明用于普通的分子生物学操作没有问题。如果用于要求较高的分子生物学试验，可以采取无水乙醇洗涤沉淀DNA、DNA溶于水而不是TE等措施除去多余盐分，从而进一步纯化提取的基因组DNA。而肾/SDS相对肾/CTAB的浓度来说，得率非常低，有可能是SDS法不适合用于提取肾脏部位DNA，肾/SDS的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值（均是最差的数值）也从另一方面说明了SDS方法提取肾脏部位的基因组DNA质量稍差。

CTAB法提取的6个组织部位的基因组DNA浓度，除了肝脏（最高）和心脏（最低）外，其余4个部位从高到低依次为脾>肾>尾>肺；而SDS法为肺>脾>尾>肾，说明在这4个组织部位中，2种方法各具优势。根据D260 nm/D280 nm的测定结果，相对于脾/SDS=1.79的比值，脾/CTAB质量稍差，达到了2.05，说明RNA没有去除完全，基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图片也说明了这一点。另外一个与SDS法差别较大的是肾脏，SDS法测的比值只有1.47，而肾/CTAB达到了1.79。说明CTAB法比较合适肾脏部位基因组DNA的提取。

总的来看，采用SDS和CTAB 2种方法对小鼠的6个组织部位基因组DNA进行提取，提取的基因组DNA基本都能满足分子生物学研究。根据琼脂糖凝胶电泳图片、DNA的浓度和纯度，及PCR扩增效果，说明SDS和CTAB这2种提取方法，对于不同的组织部位具有不同的优势。综合来看，小鼠的6个组织部位中，肝脏最合适用来作为提取基因组DNA的材料。

参考文献：

[1]萨姆布鲁克J.分子克隆实验指南[M]. 3版.北京：科学出版社，2008：461-485.

[2]Basuni A A，Butterworth L A，Cooksley G，et al. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA[J]. Journal of Viral Hepatitis，2000，7（3）：241-243.

[3]Doyle J J，Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochem Bull，1987，19：11-15.

[4]Nagori R，Sharma P，Habibi N，et al. An efficient genomic DNA extraction protocol for molecular analysis in annona reticulata[J]. National Academy Science Letters，2014，37（2）：137-140.

[5]王 文，施立明.一种改进的动物线粒体DNA提取方法[J]. 动物学研究，1993，14（2）：197-198.

[6]汪永庆，王新国，徐来祥，等. 一种动物基因组DNA提取方法的改进[J]. 动物学杂志，2001，36（1）：27-29.

[7]张 宁，王凤山.DNA提取方法进展[J]. 中国海洋药物，2004，98（2）：40-46.

[8]Di Bernardo G，Del Gaudio S，Galderisi U，et al. Comparative evaluation of different DNA extraction procedures from food samples[J]. Biotechnology Progress，2007，23（2）：297-301.

[9]Peano C，Samson M C，Palmieri L，et al. Qualitative and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and non-GMO foodstuffs with four different extraction methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（23）：6962-6968.

[10]Wu J，Lin I H，Hayes R B，et al. Comparison of DNA extraction methods for human oral microbiome research[J]. Journal of International Medical Research，2014，4（10）：1980-1991.

[11]赵晓丽，李晓霞，刘德华，等. 3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较[J]. 昆明医科大学学报，2014，35（4）：117-120.

[12]陈国明，魏海莲，李志强，等. 平菇DNA不同提取方法比较[J]. 广西林业科学，2014，43（1）：73-78.

[13]金 晶，朱 玲，高 军，等. 三种DNA抽提方法对新鲜血细胞及冻血细胞DNA抽提效能的比较[J]. 第二军医大学学报，2014，35（1）：101-105.

[14]李晓晓，赵焕英，杨云廷，等. 三种人全血基因组DNA提取方法的比较[J]. 现代生物医学进展，2013，13（27）：5221-5225.

[15]白雪嵩，赵昶灵，陈中坚，等. 5种提取三七基因组 DNA 方法的比较[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：54-56.

[16]Kennedy N A，Walker A W，Berry S H，et al. The impact of different DNA extraction kits and laboratories upon the assessment of human gut microbiota composition by 16S rRNA gene sequencing[J]. PLoS One，2014，9（2）：e88982.

[17]Vishnivetskaya T A，Layton A C，Lau M C，et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples[J]. FEMS Microbiology Ecology，2014，87（1）：217-230.

[18]李进波，盛 婧，李 想，等. 五种DNA提取方法对鱼加工制品DNA提取效果的比较[J]. 生物技术通报，2014（4）：43-49.

[19]郭 妍，惠长野，张 文，等. 牛肺基因组DNA的提取及其质量分析[J]. 中国生物制品学杂志，2014，27（5）：712-715.

[20]Palmiter R D，Chen H Y，Messing A，et al. SV40 enhancer and large-T antigen are instrumental in development of choroid plexus tumours in transgenic mice[J]. Nature，1985，316（627）：457-460.

[21]王静华.哺乳小白鼠在不同泌乳阶段乳铁蛋白（lactoferrin）基因表达的差异及铁对其表达影响的研究[D]. 杭州：浙江大学，2004：30-31.张 超，杨永智，王 舰，等. 双单倍体马铃薯DM再生体系的构建[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：50-52.