家兔DGAT1基因的克隆及其组织表达谱分析

邝良德　任永军　谢晓红　雷岷　李丛艳　郑洁　郭志强　张翔宇　张翠霞　杨超　李勤　陈天宝

摘要：采用RT-PCR技术克隆家兔DGAT1部分基因片段，并采用半定量RT-PCR技术研究其在齐兴肉兔不同组织中的表达谱。研究结果获得了DGAT1基因960 bp的编码序列，共编码320个氨基酸。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现，家兔DGAT1基因与其他物种的相似性在81.7%～89.2%之间；遗传距离分析表明，家兔与人的亲缘关系最近，与牛的最远。组织表达谱分析表明，DGAT1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、盲肠、淋巴结、背最长肌、皮下脂肪等多种组织中均有表达，且皮下脂肪中表达量最高，肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步研究DGAT1基因在家兔脂肪代谢中的生理功能提供依据。

关键词：家兔；二酰基甘油转酰基酶1（DGAT1）；半定量RT-PCR；组织表达；基因序列；遗传距离

中图分类号： S829.12 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0041-03

二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerolacyltransferase，DGAT）是脂肪细胞中甘油三脂合成过程中最后一步反应的关键酶，在细胞甘油脂类的代谢中起重要作用，其作用机制是使二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）作用于脂肪酸酰基形成三酰甘油（triacylglycerol，TAG）[1]。研究表明，DGAT基因对动物肌肉和乳汁中脂肪含量以及脂肪酸组成有显著影响，敲除DGAT1基因的小鼠虽然在肠内能继续合成甘油三酯，但不能在组织中沉积，也不能泌乳[2-6]。DGAT有2种类型：DGAT1和DGAT2，两者有54%的同源性，但是分属于不同的基因家族。DGAT1属于包括酰基辅酶A、胆固醇酰基转移酶ACAT1和ACAT2在内的蛋白家族，在很多组织中都有表达，特别是在小肠、睾丸、脂肪、乳腺和皮肤中的表达量最高[7]。在小鼠上研究表明DGAT1的表达量与小鼠的肥胖程度及脂肪组织和骨骼肌中脂肪酸的含量及成分有关[8-9]。在牛上研究发现DGAT1基因的K232A突变对奶牛产奶性状，尤其是乳脂量具有显著影响[10，11]。Wu等研究结果表明，DGAT1基因对牛的皮下脂肪有加性效应[12]。猪上的研究表明，DGAT1基因定位在SSC4p15，在这一区域内存在可能影响猪生长速度、肌内脂肪含量和脂肪酸组成的QTL[13-14]。

关于DGAT1基因的定位和结构，国内外学者在许多物种上进行了深入细致的研究。人的DGAT1基因定位于HSA8q24.3，DNA总长度10 588 bp，含有17个外显子和16个内含子。小鼠的DGAT1基因位于15号染色体D3区，遗传位置是46.9 cM，含有17个外显子，16个内含子。牛DGAT1基因位于14号染色体19 cM处，与微卫星CSSM66紧密连锁，基因全长14 117 bp，含有17个外显子和16个内含子。猪DGAT1基因定位于SSC4p15，与微卫星SW2404紧密连锁，cDNA全长1 935 bp[15-16]。目前，在家兔（Oryctolagus cuniculus）DGAT1基因研究方面，仅见 GenBank 上其基因预测序列的公布，有关家兔该基因的表达尚属空白。本研究旨在通过RT-PCR技术对齐兴肉兔DGAT1基因的cDNA进行克隆，并利用半定量RT-PCR 技术分析DGAT1基因在不同组织中的表达规律，为该基因在家兔肌肉组织脂质代谢中的功能研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及组织样本采集 选取成年健康齐兴肉兔公兔5只，来自四川省畜牧科学研究院种兔场。屠宰后立即采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、盲肠、淋巴结、背最长肌、皮下脂肪等组织样品置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要仪器及试剂 电动匀浆器（瑞士Polytron PT1200E）、Power Pac 3000电泳仪（Bio-Rad）、日本日立CR22g高速冷冻离心机、英国Biochrom公司的WPA Biowave核酸蛋白检测仪、Versa Doc 1000凝胶成像系统（Bio-Rad）。主要试剂包括Trizol试剂（Invitrogen）、反转录试剂盒（Ferments）、pMD19-T质粒（TaKaRa）等。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中家兔DGAT1预测序列以及GAPDH mRNA序列，并采用Primer Premier 5.0软件设计针对DGAT1基因的特异性克隆引物以及半定量RT-PCR引物（表1），引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取与cDNA模板合成 采用Trizol试剂法提取10种组织中的总RNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量和完整性，质量合格的RNA置于-80 ℃冰箱冻存备用。RNA反转录成cDNA模板参照TaKaTa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明，反转录产物 -20 ℃ 保存备用。

1.2.3 DGAT1基因的部分cDNA片段克隆 以冻存的肌肉组织cDNA为模板，PCR扩增DGAT1基因部分cDNA片段。25 μL PCR反应体系：灭菌超纯水15.375 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL、PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.5 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸30 s，共34个循环；最后72 ℃充分延伸10 min，10 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA回收试剂盒回收目的条带。回收产物连接于PMD19-T载体，转化后筛选阳性克隆，提取质粒并进行测序。DNA测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2.4 DGAT1基因在齐兴肉兔不同组织中的表达谱 利用冻存的齐兴肉兔各组织cDNA为模板，进行半定量RT-PCR扩增。经过对DGAT1基因、GAPDH基因的半定量PCR体系及条件优化后，25 μL PCR反应体系：其中灭菌超纯水15.8 μL、PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.0 μL、10 μmol/L正反向引物各1.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸30 s，共33个循环；最后72 ℃充分延伸10 min，10 ℃保存。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并用Quantity one软件分析，数据用DGAT1与GAPDH条带的光密度比值表示。

1.2.5 数据分析 利用BioXM 2.6、DNAMAN等软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对分析；利用MEGA 5.1构建分子系统进化树；定量结果以平均值±标准差表示，统计分析软件为SPSS 17.0。

2 结果与分析

2.1 DGAT1基因片段扩增以及重组质粒的PCR检验

采用RT-PCR方法对齐兴肉兔DGAT1基因片段进行扩增，得到1条长度约为962 bp的特异性扩增区带，与预期片段大小一致（图1）。扩增片段经连接、转化、培养后，挑取重组子，对阳性克隆进行PCR鉴定（图2），结果得到1条与设计片段一致的条带，表明目的基因已经成功转入大肠杆菌中。

2.2 DGAT1基因序列的同源性分析

将克隆测序得到的齐兴肉兔DGAT1基因序列片段（图2）与GenBank中收录的人（NM_012079）、牛（NM_174693）、小家鼠（NM_010046）、猪（NM_214051）、犬（NM_214051）、绵羊（NM_214051）和黑猩猩（NM_010046）等物种DGAT1基因相应序列相比较，发现DGAT1基因在常见物种间存在较高的相似性，其核苷酸相似性分别为89.1%、89.2%、81.7%、88.7%、87.9%、89.0%和89.1%。结果表明：哺乳动物的DGAT1基因编码区序列比较保守。

2.3 基于系统进化树的DGAT1基因亲缘关系分析

将本试验克隆测序所获得的DGAT1基因片段序列与NCBI数据库中收录的人（NM_012079）、牛（NM_174693）、小家鼠（NM_010046）、猪（NM_214051）、犬（NM_214051）、绵羊（NM_214051）和黑猩猩（NM_010046）等物种DGAT1基因相应序列用BioXM 2.6生物信息软件翻译成氨基酸序列，再利用MEGA 5.1软件对所得到的氨基酸序列进行多序列比对，采用邻接法构建系统进化树（图3）。树枝长度表示亲缘关系的远近，由图可见，家兔与人具有最近的亲缘关系，与牛的亲缘关系最远。

2.4 DGAT1基因在齐兴肉兔不同组织的表达分析

采用GAPDH作为参照基因，采用半定量RT-PCR方法分别检测了DGAT1基因mRNA在成年齐兴肉兔不同组织中的表达情况，包括脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、回肠、胃、肾脏、大脑和肌肉共10个组织，结果（图4）各组织中均表达DGAT1，DGAT1在脂肪组织中表达量最高， 并且脂肪、 肝脏以

及回肠组织中的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）。

3 讨论与结论

肌内脂肪沉积作为当今研究的热点问题，其内在分子机理尚未完全清楚。国内外研究表明，肌内脂肪的沉积主要是肌肉内脂肪细胞对甘油三酯的合成与分解的综合结果表现，而参与脂肪合成和分解的脂肪代谢酶有许多种，因此，脂肪沉积的调控机制是一个十分复杂的过程[17-20]。DGAT1在调控脂肪代谢中起到重要作用，是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶，是肌内脂肪沉积过程的重要参与者，其编码基因的表达对肌内脂肪沉积有着重要影响。目前，国内外进行了许多关于DGAT1基因的研究，但是有关家兔DGAT1基因的研究还未见报道。本试验通过RT-PCR方法从肌肉组织中克隆得到了家兔DGAT1基因部分cDNA序列，此外，将该序列与NCBI收录的其他物种DGAT1基因序列进行同源性比对分析发现，家兔DGAT1基因序列与其他常见物种间存在高度同源性，与牛、人和猪的DGAT1基因序列相比，相似性均在87%以上，将家兔DGAT1基因片段编码氨基酸序列与其他常见物种相比，相似性均在95%以上，其中与人的核苷酸和氨基酸相似性均很高，与牛、绵羊的相似性较差。通过构建系统进化树发现，家兔与人具有最近的亲缘关系，而其与牛的亲缘关系最远，这与传统分类学的结果基本一致。

本试验中，半定量RT-PCR结果表明，DGAT1基因mRNA在成年齐兴肉兔脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、回肠、胃、肾脏、大脑和肌肉中都有不同程度的表达，其中在脂肪组织中表达量最高，在肺脏中表达量最低，这与王国富等在牛上的研究结果[21]稍有不同，这可能与物种的特异性有关。总之，DGAT1在齐兴肉兔各组织中不同的mRNA表达丰度说明其对不同组织中脂肪含量有着不同程度影响，可作为一个影响兔肉品质性状的候选基因。虽然DGAT1基因的表达对于脂肪沉积有重要影响，但脂肪沉积是受到许多代谢酶调控的一个综合过程，下一步作者将对参与脂肪合成和分解的其他多种酶类编码基因的表达调控及遗传变异进行深入研究，以便进一步揭示肉兔脂肪沉积的内在机制，为培育新品种提供理论基础。

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