山东葡萄霜霉病菌致病力分化及亲缘关系研究

张眉+辛相启+吴斌+王升吉+郭霞+赵玖华

摘要：为明确山东地区葡萄霜霉病菌株的致病性及亲缘关系，本研究以不同抗性的6个葡萄品种作为鉴别寄主，采用叶盘接种法，对采自山东地区的13个葡萄霜霉病菌株进行致病性测定，并扩增每个菌株的rDNA-ITS序列进行同源性分析。结果表明，这13个葡萄霜霉病菌株均有致病性，据致病力分为强、中、弱3种致病类型，中等致病型菌株占优势，菌株间致病力差异与菌株的地域来源无明显相关性序列比对及系统发育树分析表明，这13个葡萄霜霉病菌株的亲缘关系很近，rDNA-ITS序列同源性高达99.94%，菌株间致病力差异与rDNA-ITS序列多态性不相关。

关键词：葡萄霜霉病菌；致病力分化；rDNA-ITS；亲缘关系；山东

中图分类号：S436.631.1+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）04-0095-05

葡萄霜霉病是一种世界性病害，在我国已遍布各葡萄产区，可导致年减产30%～50%[1]。葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola（Berk.&Curt.）Berl.&deToni]的致病力是否存在分化在国内外的研究中一直存有分歧。刘旭等[2]研究表明来自重庆和陕西2个地区的葡萄霜霉病菌致病力没有显著差异；Boubals[3]却发现不同来源的葡萄霜霉病菌可以表现出不同的致病力。目前由东葡萄霜霉病菌的致病力分化研究还未曾有报道，因此，本研究将采自山东地区13个不同霜霉病菌株接种于6个不同抗性葡萄品种进行致病性测定，以明确葡萄霜霉病菌的致病性特点，为该病菌的致病机制及病害流行规律研究奠定基础。

收稿日期：2014-12-01

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201203035）

核糖体内转录间隔区（internaltranscribedspace，ITS）因在真核生物种内相对保守，种间差异显著，常用于真菌物种的分类鉴定以及系统发育关系研究。贾姝等[4]利用rDNA-ITS序列分析发现，辽宁地区不同葡萄霜霉病菌株间具有一定的遗传分化；张胜菊等[5]分析了大白菜与甘蓝寄生霜霉菌的rDNA-ITS序列，表明两者均与甘蓝型油菜霜霉病菌有较近的亲缘关系。本研究从分子水平上对山东不同葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列进行比较分析，对探明该病菌的亲缘关系等遗传进化研究有重要意义。

1材料与方法

1.1供试材料

在山东地区采集的13个不同葡萄霜霉病菌株，见表1。

供试鉴别寄主为6个不同抗性的葡萄品种，分别是摩尔多瓦、夏黑、赤霞珠、玫瑰香、贵妃玫瑰和红提。

1.2生化试剂及其他

EasyTaq酶购自北京全式金公司，DNA凝胶回收试剂盒购自上海Sangon，其他常规化学药品为分析纯试剂。PCR引物合成和DNA测序均由上海Sangon完成。

1.3葡萄霜霉病菌的室内接种

1.3.1接种物与寄主植物的准备从田间采集新鲜的葡萄霜霉病叶，在流水下用毛笔刷掉病斑上老的霉层，将病叶放于人工气候培养箱中，22℃、相对湿度（RH）90%、光照黑暗各12h交替培养，待长出新的白色霉层时，取孢子囊梗及孢子囊至无菌水中，充分吸打后，将孢子囊悬浮液浓度稀释至1×105个/mL，用于接种。

选取葡萄当年生枝条自上向下第3～4节位健康无病叶片，清水洗净后，用内径15mm的打孔器打取叶盘。在直径90mm培养皿底铺1层滤纸，加入2mL无菌水，将叶盘叶背朝上放入培养皿中，每皿随机放入10个叶盘作为1个重复，每个菌株每个寄主品种重复3次。

1.3.2接种及病情调查采用叶盘接种法接种。用微量移液器吸取稀释好的孢子囊悬浮液滴加在叶盘中央，每个叶盘接种20μL。清水作对照。接种后，将培养皿放于人工气候培养箱内，22℃、RH90%、光照黑暗各12h交替培养。培养48h后，用吸水纸吸去叶盘上的接种液，相同条件下继续培养。接种7d后，计算各处理的病情指数。利用DPS软件中的系统聚类，采用卡方距离法计算各处理间的聚类距离，用离差平方和法进行聚类分析[6]。

相关计算方法及标准划分为：（1）发病率（%）=（发病叶盘数/总叶盘数）×100。（2）参考刘旭等[2]的研究划分病情分级标准，并稍加改动：0级，无病斑；1级，病斑面积占叶盘面积5%以下；3级，病斑面积占叶盘面积5%～20%；5级，病斑面积占叶盘面积20%～50%；7级，病斑面积占叶盘面积50%以上。病情指数=∑（各级发病叶盘数×相对级值）/（调查总叶盘数×7）×100。（3）抗性类型：高抗（HR），病情指数为0～5.0；抗病（R），病情指数为5.0～25.O；感病（S），病情指数为25.0～50.0；高感（HS），病情指数为50.0～100.0。

1.4葡萄霜霉病菌基因组的提取

取1.5mL离心管，加入适量的95%乙醇，用尖头镊子夹取新鲜的葡萄霜霉病菌孢子囊梗及孢子囊于乙醇中，4000r/min离心10min，去上清液，收集霜霉病菌。参考穆春华等[7]的方法提取葡萄霜霉病菌的基因组DNA。

1.5葡萄霜霉病菌rDNA-ITS序列的扩增与分析

以葡萄霜霉病菌基因组DNA为模板，用引物ITS1F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'扩增rDNA-ITS序列。PCR扩增条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min20s，35个循环；72℃终延伸10min。切胶回收目的片段，送测序公司测序。

通过DNAMAN软件和Clustalx1.83软件对rDNA-ITS序列进行比对，利用MEGA5.0分析软件中的Neighbor-Joining分析法构建系统发育树。endprint

2结果与分析

2.1不同葡萄霜霉病菌株的致病力

通过叶盘接种法将13个不同葡萄霜霉病菌株分别接种在6个鉴别寄主葡萄上，对菌株的致病性进行测定。接种7d后，发病严重的可在叶盘接种处出现较大病斑，并有大量白色霉层产生（图1A）；发病轻者没有病斑或仅可见褐色侵染点，极少或不产生白色霉状物（图1B）。从表2可以看出，供试13个葡萄霜霉病菌株均有致病性。但是，当13个菌株同时接种抗病性较强的夏黑品种时，从病情严重度来看，接种JYrf和BZdd的病指仅为0.48，而接种JYsg.DZln、DZhw和DZSdyj的病指却都达到50.00以上；从抗性反应来看，出现了高感、感病、抗病和高抗4个类型。接种高抗病品种摩尔多瓦也表现出了相似的发病特点。同时，当寄主为感病性较强的贵妃玫瑰和红提品种时，病指范围分别为28.57～79.05和27.62～77.62，病指差均在50左右。由此可以得出，山东葡萄霜霉病菌株间存在着明显的致病力分化。

对供试菌株的致病力进行聚类分析，可以看出（图2），13个菌株大致可聚为3组，第1组是致病力较强的菌株，为DZhw、DZln、JYsg和DZS-dyj，占30.8%；第Ⅱ组是致病力中等的菌株，为JNzg、XTyjz、MYxz、DZSdt、PYwt和QDnlk，占46.2%；第Ⅲ组是致病力较弱的菌株，为JYrf、BZdd和DYmt，占23.1%。因此，将13个菌株可划分为强、中、弱3种致病类型，其中，中等致病型菌株为优势菌株。

从图2还可以看出，JYrf的致病力最弱，而同样是采自济阳县的JYsg致病力最强，所以，地域来源很近的菌株可以表现为不同的致病型；同时地域来源较远的菌株JNzg、MYxz和QDnlk又可以聚在一起，均为中等致病型。因此，山东葡萄霜霉病菌致病力差异与菌株的地域来源无明显相关。

2.2供试葡萄霜霉病菌株的亲缘关系

对13个葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列进行Blast比对分析，结果显示，所有菌株与登录号为DQ665668.1的葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均为99%。因此，这13个霜霉菌株与已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的亲缘关系很近，属于同一个种。进一步比对发现，13个菌株间的同源性可高达99.94%，其中，JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的同源性为100%，DZln和QDnlk有4个碱基位点发生变异，其他菌株有1～3个碱基变异位点。由此可以得出，采自山东地区的13个葡萄霜霉病菌株之间的亲缘关系很近，但rDNA-ITS序列间仍然存在一定差异。

根据以上序列共同构建系统发育树，从树形结构可以看出（图3），JYrf、DZSdyj、DYmt、PYwt、MYxz和DZhw与已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的亲缘关系最近，聚在同一分支内，同源性为99.98%。同为来自青岛地区的DZSdyj、DZSdt和QDnlk菌株分散地聚在了不同的分支中。由此可以得出，葡萄霜霉病菌株间的亲缘关系远近与菌株的地域来源无相关性。

2.3葡萄霜霉病菌株致病力差异与rDNA-ITS序列多态性的关系

为了明确葡萄霜霉病菌株间致病力的差异是否与rDNA-ITS序列的差异有关，对致病力（图2）及系统发育（图3）进行了综合分析，可以得出，在强致病力菌株中，DZhw和DZSdyj的同源性为100%，与JYsg的遗传距离较远，rDNA-ITS序列差异较大；在弱致病力菌株中，JYrf和DYmt的同源性为100%，而BZdd则聚在了其他进化分支内。即使JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的rDNA-ITS序列完全一致，致病力也表现出了强、中、弱的差异。因此，葡萄霜霉病菌株间的致病力差异与rDNA-ITS序列的多态性无相关性。

3结论与讨论

致病性测定是真菌研究中的重要环节，可为真菌的遗传多样性、致病相关基因、致病机制等研究提供依据，因此，病原菌的接种技术是这些研究的关键所在。本研究发现，孢子囊在22℃下1h即可萌发，24h萌发率约为50%。有研究报道[8.9]，葡萄叶片气孔对游动孢子具有向性引力，游动孢子释放后会向气孔游动，约半小时后停止游动形成休止孢，长出芽管从气孔侵入。因此，我们选择刚收集到的新鲜孢子囊用于接种，以利于游动孢子在释放后迅速游动到气孔附近进行侵染，保证侵染活性及测定结果可靠性。在前期试验中对孢子囊的接种浓度也进行了摸索，发现浓度低时侵染率较低，而高浓度更利于发病，最终选用1×105个孢子囊/mL作为病菌的接种浓度，这也与Polesani等[10]、Díez-navajas等[11]和Liu等[12]在研究中所使用的孢子囊量相近，可以实现较好的发病效果。

葡萄品种的抗病性不随霜霉病菌菌源的改变而改变[13]，因此我们在前期室内、田间接种试验的基础上，挑选出6个不同抗病性且在山东地区较为普遍种植的葡萄品种作为鉴别寄主。本研究结果表明，13个葡萄霜霉病菌株均具有致病性，并且存在明显的致病力分化，由此推测，有不同生理小种的存在，这Boubals[3]的研究发现相一致。此外，李华[14]的研究结果也表明，不同霜霉病菌株接种不同抗性葡萄品种，菌株间表现出了致病力差异，但不存在寄主-病原间的特异性互作，由此提出了葡萄与葡萄霜霉菌之间的水平系统学说，同时，他还认为，葡萄霜霉病菌的致病力差异首先表现在其孢子囊大小和其中所含细胞核数量的差异，换言之，就是霜霉菌的异核现象引起了致病力的不同[15]。研究中我们还发现，有些菌株在接种抗病性较强的摩尔多瓦和夏黑时，叶盘上特别是接种点处会出现褐色点状侵染斑（图1B），镜检发现这些变色组织主要集中在气孔周围，此前有相关报道认为抗病葡萄叶片在受到霜霉菌侵入时会在气孔周围形成胼胝质沉积物[16]，这一物质会穿透寄主细胞形成一道屏障从而阻止侵染菌丝进一步展[9]，同时还会阻断吸器与寄主细胞之间的物质交换[17]，所以这些侵染斑可能是因胼胝质的阻碍使得生长受到局限的霜霉菌引起的症状。但相对于出现以上侵染表型的菌株，JYsg、QDnlk和MYxz仍然可以在摩尔多瓦叶盘上长出较多霉层，因此该病菌的致病机理还需进一步研究。

目前，rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌的分类鉴定、种间亲缘关系研究、植物病原真菌检测等方面已得到广泛应用。为了弄清这13个葡萄霜霉病菌株的亲缘关系，我们对它们的rDNA-ITS序列进行了Blast分析，结果表明这13个菌株与GenBank中的DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均为99%，而且菌株间的同源性可高达99.94%，差异菌株只发生了个别碱基位点的变异。这与贾姝等[4]的研究结果相一致，他们在辽宁地区采集了21个葡萄霜霉病菌株，这些菌株也都与DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，并且菌株间的遗传距离很近。这些都说明，rDNA-ITS序列在葡萄霜霉病菌的种内是非常保守的，这将为该病菌的遗传进化研究提供参考。endprint