四川省具有子根茎重楼的资源调查及品质研究

陈铁柱，林 丹，汪 瑶，文飞燕，张驿帆，张 浩*

(1．四川省中医药科学院，四川成都610041;2．四川大学华西药学院，四川成都610041)

重楼是西部药用植物中占据产业化利用主导地位、最具代表性和全局影响力的药用植物资源之一。但其植物资源严重枯竭，目前已有一定数量的公司和个人开始了试验性研究，进行大规模的引种栽培。但栽培现状比较混乱，主要体现在繁殖方式上，即野外采挖直接种植、根茎切割繁殖［1］、全根茎切割［2］、种子繁殖［3－5］，以上 4 种繁殖方式均不能打破重楼的生物学特性(生长缓慢、生长周期长、繁育系数低)，其目前的繁殖方式已经严重制约了其资源再生和产业化发展。然而，经长期野外调研和产地调查发现，在极其特定的环境下，重楼根茎会自然分根，即一个根茎上分根3～15株不等子根茎。子根茎移栽后，表现了明显的速生性，3～4年后即可作商品药材。此种分枝繁殖的方式提高了重楼3～15倍的繁殖系数，缩短了重楼6～7年的生育周期，产业化栽培前景非常好。笔者拟对能分枝繁殖出子根茎的重楼的环境因子和内在因子进行研究，明确分枝繁殖重楼的具体环境生态条件，通过有效成分含量测定分析，明确是否有药用价值，以期为产业化生产提供理论基础和技术保障，为实现重楼资源再生策略和行动方向提供有效的借鉴手段和方法。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药材来源。在查询标本的情况下设定的走访调查后，采到的具有子根茎的重楼药材产地为四川省彭州市白鹿镇、四川省崇州市街子古镇和鸡冠山镇(表1)，由四川大学华西药学院生药学教研室张浩教授进行原植物鉴定。留样凭证标本存放于生药学标本室，所有样品均有原植物数码照片。

表1 子根茎重楼样品来源

1．1．2 仪器。LG－10A日本岛津高效液相色谱仪;岛津LabSolution色谱工作站;D1810D自动纯水蒸馏器。

1．1．3 试剂。重楼皂苷I、II对照品购自中国药品生物制品检定所，其余6个皂苷对照品均为华西药学院生药201－203#实验室人员分离得到(图1)，分别为化合物1(重楼皂苷Ⅶ)、化合物2、化合物3(重楼皂苷H)、化合物4(重楼皂苷Ⅵ)、化合物5(重楼皂苷Ⅱ)、化合物6(纤细薯蓣苷)、化合物7(重楼皂苷Ⅰ)、化合物8(重楼皂苷Ⅴ)。乙腈为色谱纯;甲醇为色谱纯;水为双蒸水。

图1 重楼皂苷对照品1～8分子结构

1．2 方法

1．2．1 资源调查方法。

1．2．1．1 文献检索查证，确定调查区域。通过查阅中国数字植物标本馆及四川省中医药科学院标本馆重楼标本，以及走访成都荷花池药材市场的市场信息人员，明确了四川省重楼主要分布区域，确定了四川省洪雅市、峨眉山市、屏山县、天全县、芦山县、宝兴县、崇州市、邛崃市、彭州市、大邑县、什邡市、安县、巴中市为主要调查区域。

1．2．1．2 走访调查。走访调查当地药农、药材收购点、药材公司、饮片加工企业、农业局、科技局、药监局等相关工作人员，了解野生重楼资源的分布情况。并走访当地气象部门，查阅气候资料，了解当地气候变化情况。

1．2．2 品质测定方法。

1．2．2．1 色谱条件的确立。含量测定前系统适应性各项考察均参照《中国药典》一部(2010年版)重楼药材项下的含量测定相关操作［6］以及刘显波的方法［7］进行。色谱条件为色谱柱Kromasil C18柱(250×4．6 mm，5 μm)，Dikma C18保护柱(12．5 ×4．6 mm，5 μm);流动相为A(乙腈)∶B(水)二元梯度洗脱，梯度洗脱程序如表2所示;流速1．0 ml/min;柱温35℃。氮气流速为3．0 ml/min。检测器漂移管温度设置为102℃。进样体积为20 μl。

表2 梯度洗脱条件

1．2．2．2 对照品溶液制备。精密称取各种皂苷对照品，用色谱甲醇定容于2 ml容量瓶中，制备混合对照品溶液，备用。1 ～8 号对照品浓度分别为 1．57、1．75、2．70、0．92、1．46、1．80、0．80、1．22 mg/ml，其色谱图如图 2 所示。

1．2．2．3 供试品溶液的制备。重楼样品低温干燥后打粉过筛(40目)。精确称量粉末约0．50 g，加入50 ml甲醇，浸泡4 h后超声提取30 min，过滤。重复上述操作1次，合并滤液，回收至干。加入色谱甲醇溶解并定容至10 ml，经0．45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1．2．2．4 线性关系考察。精密吸取“1．2．2．2”混合重楼皂苷对照品溶液4、6、10、12、16、20 μl注入高效液相色谱仪，测定其峰面积值，以进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行回归分析得回归方程，其线性回归方程、相关系数、线性范围如表3所示。

图2 1～8号对照品溶液色谱图

表3 对照品标准曲线数据

1．2．2．5 精密度试验。精密吸取“1．2．2．2”混合重楼皂苷对照品溶液，分别在“1．2．2．1”色谱条件下连续进样 6 次，每次进样20 μl，分别测定峰面积，计算皂苷1～8号对照品的RSD 分别为 1．65%、1．01%、1．25%、2．01%、0．94%、1．83%、1．21%、1．78%，均小于3%，表明进样精密度良好。

1．2．2．6 重复性试验。精密称取同一批样品(HCS1)6份，均按《中国药典》2010版本重楼项下含量测定方法相关操作［6］制备供试品溶液，在“1．2．2．1”色谱条件下测定 8 种重楼皂苷的峰面积，计算皂苷1～8号的RSD分别为1．32%、1．04%、1．75%、1．43%、1．21%、1．63%、2．14%、2．35%，表明方法的重复性较好。

1．2．2．7 稳定性试验。取同一批样品(HCS1)溶液，间隔0、4、8、24、48 h，进样5 次，每次 20 μl，按照“1．2．2．1”色谱条件进行测定。计算皂苷1～8号的RSD分别为0．74%、0．45%、0．78%、0．83%、0．64%、1．17%、0．95%、1．25%，表明供试品溶液稳定性良好。

1．2．2．8 加样回收试验。精密称取6份已测知含量的同一批华重楼药材(HCS1)，精密加入皂苷1、3、5、7号的对照品溶液适量，按《中国药典》2010版重楼项下含量测定方法相关操作［6］制备供试品溶液，在“1．2．2．1”色谱条件下测定 4种重楼皂苷的峰面积，计算皂苷1、3、5、7号对照品的加样回收率分别为 97．41%、96．84%、97．73%、98．81%;RSD 分别为1．83%、2．04%、1．45%、1．79%。

1．2．2．9 样品测定。精密称取不同重楼药材粉末约0．50 g。按“1．2．2．3”方法制备供试品溶液，按“1．2．2．1”色谱条件进样20 μl，测得1～8号供试品色谱峰的峰面积，算出各样品皂苷含量。

2 结果与分析

2．1 子根茎重楼的资源调查产地条件分析

2．1．1 分布条件。调查结果发现，具有子根茎的重楼主要集中分布在四川省的彭州市和崇州市，子根茎重楼资源分布范围较广，北至彭州市的白鹿镇、南至崇州的鸡冠山镇，103°22'48″～103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 区域内低山至高山均有分布，集中分布在海拔533～1 220 m的区域，土壤以弱酸性山地黄棕壤为主，土质疏松肥沃(表4)。

表4 子根茎重楼资源的小生态环境

2．1．2 气候条件。子根茎重楼主要分布在亚热带季风带气候区(表5)。夏季较凉爽、冬季不严寒，年均温度变化比较平缓，较少出现极冷极热现象，年降水量比较充足(960～1 012 mm)，相对湿度较大(70% ～82%)，年平均温度15．7～15．9 ℃，最冷月平均气温5．4 ～7．5 ℃，最热月平均气温25．0～26．2℃，年均日照时数为1 161～1 180 h，无霜期278～285 d，以上条件为子根茎重楼适宜的生长条件。

表5 子根茎重楼分布区的气象数据

2．1．3 土壤条件。土壤类型主要是山地黄棕壤，pH变化范围为5．23～5．68(表4)，弱酸性。黄棕壤是最有利于重楼子根茎的生成，此种类型的土壤土层较厚、有机质含量高，其垂直结构为0～6 cm为枯枝落叶层、6～18 cm为腐殖层、18～39 cm为过渡层、39～100 cm为淀积层，为重楼的生长提供了足够的营养，促进形成子根茎。

2．2 子根茎重楼中皂苷含量分析

2．2．1 不同产地子根茎华重楼中皂苷含量。彭州10组具有子根茎的华重楼(HCS1)化学物1～化合物8均有检出，重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的总量均达0．980 9%(表6)，达到《中国药典》2010版重楼项下规定的最低0．60%的限量标准。同时，对从彭州8组具有子根茎的华重楼摘下子根茎(HCB2)进行了检测，发现HCB2重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的含量不足HCB1的50%。对4批次崇州街子古镇具有子根茎的华重楼(HCJ1～HCJ4)进行检测，每次均检测出重楼皂苷Ⅶ、化合物2和重楼皂苷H，2014年10月采收的华重楼(HCJ2)重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量为1．123 0%，是崇州街子古镇4批次检测样品中唯一符合《中国药典》重楼项下0．6%的限量标准的样品。崇州市鸡冠山镇具有子根茎的华重楼重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量为0．094 2%，为检测的8个批次子根茎华重楼中含量最低的。崇州市鸡冠山镇具有子根茎的华重楼为一根双株，皂苷含量低可能是双株消耗了过多的营养，导致生成的重楼皂苷含量低。

2．2．2 同一产地具有子根茎的不同品种重楼皂苷含量。经实地调查(表6)，崇州鸡冠山镇这一特定产地，发现5个重楼品种中某一单株均有子根茎现象，且子根茎发育成双株或多株重楼。除了对具有子根茎的华重楼测定外，对具有子根茎且多株的卷瓣重楼、狭叶重楼、五指莲、黑籽重楼皂苷含量也进行了测定。测定结果发现，只有双株子根茎黑籽重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量达到了《中国药典》重楼项下0．6%的限量标准，其他品种均未合格。对具有子根茎黑籽重楼主根中摘除的小根茎进行了测定，发现重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根茎的50%，与子根茎华重楼测定结果趋势一致。

表6 重楼样品中8种皂苷的含量%

3 结论与讨论

(1)对有多芽分根繁殖的重楼区域进行调查，发现根茎重楼适宜的生长条件为在 103°22'48″～ 103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 533 ～1 200 m 的区域，土壤以弱酸性山地黄棕壤为主，年平均温度15．7～15．9℃，最冷月平均气温5．4～7．5 ℃，最热月平均气温25．0 ～26．2 ℃，年均日照时数为1 161～1 180 h，无霜期278～285 d。

(2)对不同产地华重楼皂苷含量进行了测定，在8个批次样品中，只有2个批次样品重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量达到《中国药典》重楼项下0．6%的限量标准，对小根茎皂苷含量进行了测定，发现其皂苷含量不足主根茎的50%，可能是由于用来检测的子根茎生长仅为1年左右，有效成分还在积累阶段，所以皂苷含量明显很少。同一产地不同品种重楼含量测定发现，只有双株子根茎黑籽重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)达到了《中国药典》重楼项下0．6%的限量标准，卷瓣重楼、狭叶重楼、五指莲重楼均未合格。

(3)对黑籽重楼中摘除的小根茎进行了测定，发现重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根茎的50%，与子根茎华重楼测定结果趋势一致。

(4)子根茎重楼皂苷含量部分可以达到药典标准，且随着重楼年限的生长，含量可能会逐渐增长，会有确切的疗效，可以作为一个新的研究方向研究，能有效提高重楼的繁殖系数、缩短生育周期。

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