一株高效慢生型花生根瘤菌的筛选

孙杉杉，朱瑞艳，杜迎辉，徐志文 (领先生物农业股份有限公司，河北秦皇岛066000)

花生是一年生豆科植物，有丰富的营养价值，富含维生素、蛋白质和脂肪，是世界上种植面积最大的油料作物，在我国各地均有种植。作为我国主要的油、粮两用作物，花生是营养比较全面的作物食品［1］。

花生根瘤菌能与花生形成共生根瘤，固定空气中的氮气，为植物生长提供营养，提高花生的产量和品质，可使花生在贫瘠的土壤中生长。花生根瘤菌与花生通过有效的共生固氮作用可提供花生生育期有效氮素的50%［2］。因此，用高效固氮根瘤菌菌株制成的根瘤菌菌剂应用在农业生产上具有效果好、成本低、不污染环境、增加土壤氮素、提高土壤肥力的作用［3］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基。固体和液体培养均使用YMA培养基，组成为:10 g甘露醇、0.8 g酵母浸膏粉、0.25 g 磷酸氢二钾、0.25 g磷酸二氢钾、0.2 g硫酸镁、0.1 g氯化钠、15～20 g琼脂、1 000 ml蒸馏水，pH 6.8 ～7.0。

1.1.2 土样。从山东、河北、河南、辽宁4个花生种植地区，取回20个土样。

1.1.3 花生品种。供试品种为冀花4号

1.2 试验方法

1.2.1 花生根瘤菌的捕捉。将10 g土壤样与90 g无菌水加到三角瓶中，振荡摇匀，得到10-1稀释度的土壤悬液;取10 ml土壤悬液，加90 ml无菌水，振荡摇匀，得到10-2稀释度的土壤悬液;按照同样方式，制备得到10-3、10-4、10-5稀释度的土壤悬液。

将1 ml上述土壤悬液接种到花盆中(花生种子已萌芽)，在花盆中以蛭石为培养介质对花生种子进行培养，定期浇灌常规低氮培养液。在培养1～2个月后，收获的植物均有根瘤［4］。

1.2.2 根瘤菌的分离、纯化。

1.2.2.1 分离。将根瘤洗净，用剪刀剪下，带点根，选取个大、粉红的，分别按编号放入离心管中，加浓度95%乙醇浸泡30 s，以消除表面张力，倒出后直接加浓度0.2%的氯化汞消毒2～5 min，然后用无菌水冲洗五六次，用无菌不锈钢钎子捣碎，用接种环蘸取汁液划线接种于斜面试管，重复1次。

1.2.2.2 纯化。先准备好带玻璃珠加水的无菌试管或离心管一支，从试管长出的菌落上挑取一环于管内水中，振荡1 min制成均匀、分散的菌悬液，取一环在YMA培养皿上划线接种，重复1次，于28℃恒温培养箱中倒置培养，3 d后观察菌落生长情况，如不纯，按上法反复纯化［4］。

1.2.3 根瘤菌的回接结瘤试验。将之前纯化好的菌种用YMA培养基培养，制成发酵液备用。将蛭石装入小花盆中，加入低氮培养液至饱和，高压灭菌。将事先萌芽好的健康、芽长一致的花生种子栽入花盆中，在种子周围加入事先培养好的发酵液1 ml。种植1～2个月后观察。

1.2.4 根瘤菌的鉴定。样品总DNA的制备按常规的细菌DNA提取方法进行。PCR引物有正向引物27F，反向引物1492R。PCR反应体系20 μl，反应液组成为:1 μl DNA模板，10 μl 2 ×MastarMix，0.4 μl 27F ，0.4 μl 1492R，超纯水补足至20 μl。PCR扩增程序为:95℃ 2 min;30个循环(84℃ 1 min，52℃ 1 min，65 ℃ 8 min);65 ℃ 18 min。

扩增产物经浓度0.7%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京三博远志公司测序。将测到的DNA序列进行人工矫正后，使用NCBI中的BIAST软件在线比对。经比对，所鉴定的9个菌株与大豆根瘤菌的相似度为99%。所以，断定这9个菌株均为根瘤菌属。在回接试验中，与花生有较好的结瘤效果，于是可以确定它们为花生根瘤菌。

1.2.5 盆栽试验。花生表面消毒后催芽7～10 d;制备各个试验菌株的发酵液;选取芽长一致的花生种子，在发酵液中浸泡10 min后移入装有蛭石的花盆(13×15 cm)中培养;每盆留1株苗，一个菌株为1组，每组8个平行，另外设计以清水浸种的空白一组，对照菌株一组。定期浇水，调查，种植4个月以后收获。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌的捕捉、分离、纯化 对20个土样进行根瘤菌的捕捉、分离、纯化，最终获得20株野生型菌株。

2.2 根瘤菌的回接试验 确定根瘤分离物是否为共生细菌的最好方法是回接试验。只有在原宿主上回接结瘤，才能确定是哪种植物的根瘤菌。

将活的20株野生菌株分别与花生进行结瘤试验。经过近2个月的培养观察，发现其中9个菌株与宿主花生有较好的结瘤效果，在不同程度地促进植物生长，而其他11个菌株结瘤效果较差，促生长效果不明显，有些还会使作物根部变成褐色。因此，经过初筛，初步确定有9个菌株为花生根瘤菌。

2.3 花生根瘤菌的16s rDNA鉴定和生理生化鉴定 经过16s测序，与大豆根瘤菌基因的相似度达99%以上，为根瘤菌属。结合回接试验结果，可以确定该9株根瘤菌为花生根瘤菌。

将9个菌株分别接种在牛肉膏-蛋白胨培养基中，在温度28℃下培养5 d。如果培养液澄清，菌体未见生长，与未接种菌株的对照相同，那么表明该菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培养基上生长。将9个菌株分别在BTB平板上温度28℃下培养7 d。如果平板颜色变蓝，那么说明该菌株在BTB平板上产碱，属于慢生型菌株。将9个菌株分别在石蕊牛奶培养基中28℃下培养7 d，培养基颜色变蓝，并且形成乳清环，表明该菌株产碱，属于慢生型。3-酮基乳糖反应呈阴性，菌落周围未出现黄褐色沉淀，表明该菌株为非土壤杆菌。通过上述方法，判定所筛选的9个菌株均为慢生型花生根瘤菌。

2.4 花生根瘤菌盆栽试验结果 分离的9株慢生型花生根瘤菌按采集地区分别命名为 ZMW、LX、XCW、XWW、YS、YSW、ZW、DMW、WDW。另取该公司公开销售的一株花生根瘤菌株144，将上述10个菌株进行盆栽比较试验。按照常规的调查方法，待花生植株生长到花期时，开始调查结瘤数、干重、全氮，培养约4个月时调查产量。

由表1～4可知，与对照相比，施用过花生根瘤菌WDW菌液的花生植株单株结瘤数提高925.6%，单株干重提高63.6%，单株全氮含量提高18.1%，单株产量提高57.9%。与现有生产使用的花生根瘤菌144相比，单株结瘤数提高27.4%，单株干重提高8.7%，单株全氮含量提高6.5%，单株产量提高30.45%。所选的花生根瘤菌菌株WDW能明显提高结瘤量和产量，提高植物的固氮能力，有效促进植物的生长发育。

3 结论与讨论

研究中，只对植株的结瘤数、干重、全氮和产量进行了调查，没有对固氮酶活力进行研究。但是，有研究表明，结瘤数与固氮酶活性间也有一定的关系。张宏等［5-7］研究也阐述了这一规律。另外，根瘤菌存在一定的地域性［8-10］，所以在菌剂的开发和实际的应用过程中要因地制宜。

［1］吴海燕.花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效果研究［D］.长春:吉林农业大学，2002.

［2］李力曹，曹凤明，徐玲玫，等.花生根瘤菌的抗逆性初步研究［J］.微生物学通报，2000，27(1):42-47.

［3］刘惠琴.根瘤菌肥料及其应用［J］.土壤肥料，1994(1):37-40.

［4］陈文新，汪恩涛.中国根瘤菌［M］.北京:科学出版社，2011.

［5］张宏，张桂芝，赵贵彬，等.黑土中土著大豆根瘤菌的固氮活性、结瘤性状和固氮量估测［J］.大豆科学，1986，5(1):47-56.

［6］肖亦农，徐琼.大豆根瘤菌HH103菌株培养基的筛选与优化［J］.微生物学杂志，2011，31(6):92-95.

［7］FELIX J F，OBATON M，MESSIAEN C M，et al.Nitrate reductase and nitrogenase ac-tycities of common beans(Phaseoluscalgaris L.)from different geographic locations［J］.Plant and Soil，1981，63(3):427-437.

［8］刘灵芝，陈玉玲，陈志刚，等.北方地区大豆根瘤菌的生物学特征［J］.土壤通报，2007，38(1):141-144.

［9］杨江科，谢福莉，周俊初.江汉平原及其周边地区花生根瘤菌的遗传多样性［J］.生态学报，2003，23(3):504-511.

［10］刘杰，汪玲玲，汪恩涛，等.河北地区花生根瘤菌的系统发育多样性研究［J］.中国农业科学，2006，39(2):344-352.