酿酒酵母DL28转化产γ-氨基丁酸主要影响因子的筛选

乌云达来，郭雪娜，张博润，王肇悦*

(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018;2.中国科学院微生物研究所，北京100101)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)简称 GABA，是谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)生物催化L-谷氨酸或钠盐α-羧基脱羧反应而产生的非蛋白质组成的天然氨基酸［1－2］，为哺乳动物中枢神经系统的一种主要的抑制性神经递质［3］，广泛存在于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中［4］，具有许多重要的生理功能，如降血压［5］、镇痛［6］、治疗哮喘［7］等。近年来，GABA 相关功能性食品的开发引人关注，其中植物富集法(米胚、米糠、绿茶等)和微生物发酵法(乳酸菌、酵母)制得的富含GABA食品都获得了良好的社会价值和经济效益。因此，GABA作为一种功能性因子越来越广泛地用于食品、医药及化工等行业［8－11］。

酵母菌是单细胞真核生物，在我国已有2 000多年的使用历史，如在酿酒业上的应用，也是我国重要的微生物资源［12－13］。据研究报道，已筛选出发酵产生较高GABA产量的酵母菌株，如 Candida parapsilosis GPT-5-11为 1.76 g/L［14］、产 GABA 酵母菌株的 GABA 产量达 1.69 g/L［15］、Saccharomyces uvarum 4#为 3.653 g/L［16］等。

Plackett-Burman试验设计是一种经济而有效的二水平试验设计方法，试验组合数量较少也满足试验要求，且因子的交互作用仅部分的与主因子发生混淆［17］，应用于生物工艺优化研究中的报道很多，如粪肠球菌HX-3-6产γ-氨基丁酸发酵条件的优化［11］、嗜酸乳杆菌NX2-6产细菌素的发酵条件优化［18］等。笔者通过Plackett-Burman设计对酿酒酵母重组菌转化产生GABA具有影响的内在因素和外在因素进行研究，筛选出主要影响因素，为其发酵条件的优化提供试验数据具有重要实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。S.cerevisiae DL28是中国科学院微生物研究所工业微生物与生物技术研究室将产GABA的S.cerevisiae 28［19］通过聚合酶链反应和核酸体外扩增技术改良的谷氨酸脱羧酶基因(GAD 1)高效表达的重组菌株。

1.1.2 主要培养基及试剂。YEPD液体培养基根据文献［20－21］介绍的方法配制;GABA标样，Sigma公司;L-谷氨酸，国药集团化学试剂有限公司;其他试剂及药品均为分析纯。

1.1.3 主要设备。Eppendorf高速冷冻离心机，5415R型和5804R型;分光光度计，SHIMADZU UV-2450型。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株DL28的培养及菌悬液的制备。将S.cerevisiae DL28菌株接种于5 ml YEPD液体培养基中，置29℃、摇床培养12～24 h。传代培养2次后接种于YEPD液体培养基中，置29 ℃、摇床培养12 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃掉上清液，加入与培养液等量的灭菌生理盐水(约5 ml)，振荡混匀，再次离心，同法洗涤2次。然后，弃掉上清液的菌体加入4.5 ml灭菌生理盐水，振荡混匀，即成为供试菌液。

1.2.2 标准曲线的建立。采用 Berthelot法［21－22］建立 GABA标准曲线，即取30 mmol/ml标准 GABA 溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 ml，依次加 30 mmol/ml L-Glu 溶液 0.35、0.30、0.20、0.10、0 ml，混合，加入0.2 ml碳酸钠溶液(1.0 mol/L)混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液(0.2 mol/L)，混匀，加入 1.0 ml 6.0%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在波长640 nm下测定其吸光值，以L-Glu溶液做空白对照。以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 转化液中GABA含量的测定［22－23］。转化液中 GABA含量的测定方法同上。将转化液0.5 ml与0.2 ml碳酸钠溶液混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液，混匀，加入1.0 ml 6%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在640 nm下测定其吸光值。

1.2.4 GABA转化条件关键影响因子的筛选——Plackett-Burman设计。通过Berthelot法以菌体浓度、底物浓度及起始pH等6个因素作为研究对象，从中筛选对菌株DL28转化产生GABA有显著影响的因子。选取的6个因素及其代码、编码水平见表1，其响应值为每组转化液中GABA含量(mmol/L)。利用JMP软件进行试验设计、数据分析及模型的建立。该试验采用二水平Plackett-Burman设计，试验设计见表1。

表1 影响因素及编码水平Plackett-Burman设计

2 结果与分析

2.1 GABA标准曲线的建立 通过Berthelot比色法，以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值(A640)为纵坐标绘制标准曲线，GABA的标准曲线见图1。

经数据分析得知，GABA的标准曲线回归方程式为Y=0.014 4X+0.412 1，相关系数 R2=0.999。因此，待测转化液中GABA浓度在4.0～30.0 mmol/L的范围内与吸光值的相关性很好。

2.2 转化液中GABA含量的测定 PB试验结果及其响应值见表2，各因素方差分析见表3。采用JMP软件对表3中的Y值(GABA含量)进行方差分析，该数据具有统计学意义(P＜0.000 1)。通过逐步回归分析，得到转化液GABA含量为响应值的最优多元线性回归方程(α=0.05):

式中，Y为GABA含量预测值;由自变量编码方程可知，x1=(菌体浓度－2)/1，x5=(转化时间－36)/12，x6=(起始 pH－4.5)/0.5。

方差分析表明，所得最优多元线性回归方程达到极显著(P ＜0.000 1)，而且各因子系数均有意义(P ＜0.05)。该回归模型在被研究的整个回归区域拟合的很好。决定系数R2=0.952 076 和 R2Adj=0.916 133，Y 值(GABA 含量)表明95.2%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。由偏回归系数及显著性检验得到影响菌株DL28转化GABA主要影响因子为:菌体浓度(P=0.012 3)、转化时间(P=0.047 5)和起始 pH(P=0.001 9)。

表2 Plackett-Burman试验设计及响应值

S.cerevisiae DL28转化产生GABA的含量受内条件(如菌体浓度、底物浓度等)和外条件(如转化温度、转化时间等)的制约。因此，为提高该菌株通过转化产生GABA的含量，首先从众多的相关影响因素中筛选出主要影响因子，并了解转化因素之间的相互作用是至关重要的。由显著因素的偏回归系数和重要影响因子动态预测图(图2)可知，在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势。

谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)是一种磷酸吡哆醛(PLP)类酶，是生物体催化L-谷氨酸或钠盐脱羧反应生成非蛋白质组成的天然氨基酸GABA的唯一酶［24－25］。因此，GAD的含量和活性对GABA产量的影响最重要，该研究中菌体浓度、转化时间及起始pH对菌株DL28转化产GABA的产量具有显著影响也说明了这一点，如菌体浓度对应GAD的含量，而转化时间和起始pH是对应GAD活性。据研究报道，Candida parapsilosis GPT-5-11合成γ-氨基丁酸的最佳pH为6.5和37℃发酵时间为48 h［26］;酵母菌突变菌株的最佳接种量为4%、起始pH为5.5及37 ℃培养时间为4 d［27］;L.plantarum LpL328 的固定化细胞在菌体浓度为6%、pH为4.7及37℃培养20 h时GABA最高催化产量为 0.96 g/L［28］;Lactococcus lactis 1.009 的细胞在菌体浓度为10 g/L、pH 4.7的醋酸缓冲液及50℃下反应60 h 时 GABA 的积累量可达 19.1 g/L，转化率为99.9%［29］等。增加菌体浓度和延长转化时间对GABA产量具有促进作用，但乳酸菌的GAD的最适起始pH相对低于酵母菌，原因由菌株特性所致。

用上述方程对转化液GABA含量最大预期值及合意性(图2)进行分析，可知欲得到较高的含GABA的转化液，需提高菌体浓度和起始pH，并延长转化时间。

表3 偏回归系数及显著性检验

3 结论

利用PB试验设计对S.cerevisiae DL28转化产GABA的菌体浓度、底物浓度、转化温度等6个相关因素进行主要影响因子的筛选，发现在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随着菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势，其他相关因素没有显著效应。通过动态预期图直观地了解到各因素的效应趋势及大致水平范围，为进一步优化酵母菌转化产GABA的工艺参数提供了重要的理论依据与实践基础。

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