FLT3突变急性淋巴细胞白血病的临床特征△

唐克晶 林冬 魏辉 刘云涛 周春林 王迎 秘营昌 王建祥 王敏

中国医学科学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020

FLT3基因位于染色体13q12，全长约100 kb，包含24个外显子，编码含993个氨基酸残基的蛋白，FLT3蛋白属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），即血小板源性生长因子受体亚家族[1-2]。FLT3与其配体之间的相互作用在造血干细胞和祖细胞的增殖、分化及存活中发挥十分重要的作用[3-5]。当配体与FLT3的细胞外结构域结合时，FLT3发生二聚体化，可介导一系列细胞内信号的转导，导致细胞的增殖和分化。如果FLT3基因发生突变，突变的FLT3能够在非配体依赖的条件下发生自身磷酸化和组成性激活，进而引起下游信号的异常转导，影响造血系统的正常发育，产生抗凋亡和分化阻滞两种致癌作用[6-7]。有研究表明，FLT3-ITD及FLT3点突变与急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）密切相关，并已证明FLT3-ITD是AML独立的不良预后因素[8]，一些研究也提示，存在FLT3-TKD的AML患者预后不良[9]。目前，有关ALL患者中FLT3基因突变的研究较少[10]。我们检测了147例ALL患者的FLT3突变情况，以探讨FLT3突变在ALL中的发生率及临床特点。

1 资料和方法

1.1 一般资料

入组2006年7月至2011年10月我院收治的ALL初诊患者共147例，其中男性有86例，女性61例，中位年龄为20岁（1.7～68岁）。诊断和分型标准参照张之南等编著的《血液病诊断及疗效标准》[11]，其中T细胞亚型（T-ALL）患者有29例（19.7%），B细胞亚型（B-ALL）患者有 97例（66.0%），费城染色体阳性亚型（Ph+ALL）患者有21例（14.3%）。

1.2 基因组DNA的制备

采集患者新鲜骨髓5 ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞后，以血液、细胞基因组DNA提取试剂盒（Tiangen公司产品）提取DNA，测定A260nm/A280nm值确定DNA产物的浓度及纯度，并用去离子水将基因组DNA样本稀释至300 ng/μl。

1.3 产物的扩增

1.3..11FLT3-ITD-ITD片段的扩增 具体方法参照Ki yoi等[12]的文献：根据第14、15外显子序列设计引物，PCR法扩增产物为329 bp，包含整个近膜区和激酶结构域的起始部位，覆盖了大多数文献报道的ITD所在区域。引物由上海Invitrogen公司合成，上游引物序列为5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′，下游引物序列为 5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′。

扩增反应体系：2×Taq PCR mastermix（Tiangen公司产品），上、下游引物各20 pmol/μl，900 ng 基因组DNA为模板，加去离子水至终体积50μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次，72℃延伸10 min。10μl扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外光透视仪分析图像并照相，出现额外大于野生型FLT3的条带即为ITD阳性产物。

1.3..22FLT3-TKD-TKD片段的扩增 具体方法参照文献[13]：根据第20外显子和内含子序列设计引物，扩增产物为194 bp，包含了TKD的关键部位A-loop，此扩增产物覆盖了大多数D835和I836（Ile836）点突变所在区域。引物由上海Invitrogen公司合成，上游引物序列为 5′-CCAGGAACGTGCTTGTCA-3′，下游 引 物 序 列 为 5′-TCAAAAATGCACCACAGTGAG-3′。

反应体系：2×Taq PCR mastermix（Tiangen公司产品），上、下游引物各20 pmol/μl，900 ng基因组DNA为模板，加去离子水至终体积50μl。反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次，72℃延伸10 min。酚-氯仿抽提纯化扩增产物，以备酶切分析。

1.4 限制性酶切PCR产物分析

将所有检测患者的FLT3-TKD扩增产物进行EcoRⅤ（Takara公司产品）酶切。大多数FLT3-TKD点突变均为D835或I836错义突变，而D835和I836组成了EcoRⅤ的酶切位点GATATC。如果此部位未发生突变，那么FLT3-TKD的扩增产物（194 bp）将会被EcoRⅤ酶切成129 bp和65 bp两个片段。相反，有突变的产物经EcoRⅤ酶切后会出现一个未被切开片段（194 bp）和两段被切开片段（129 bp和65 bp）。

酶切反应体系：10×buffer 2 μl，EcoR Ⅴ内切酶（10 U/μl）1μl，扩增纯化产物10 μl，ddH2O 7 μl，总体系为20μl。反应条件为37℃ 3 h。取10μl反应液经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料用率表示，采用χ2检验，以p＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ALL患者中FLT3突变的发生率

147例ALL患者中，共检出FLT3突变11例，FLT3突变在ALL中的总发生率为7.5%，其中FLT3-ITD突变3例（2.0%），FLT3-TKD突变8例（5.5%）。FLT3-ITD野生型和突变型扩增产物的电泳结果如图1所示，FLT3-TKD野生型和突变型扩增产物的EcoRⅤ酶切电泳结果如图2所示。

2.2 FLT3突变阳性和阴性患者的一般资料比较

147例患者中，3例为ITD突变，8例为TKD突变，136例为FLT3野生型（表1）。进一步研究结果显示，FLT3突变者与无突变者在年龄、性别、骨髓原始细胞计数和外周血原始细胞计数方面的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。尽管FLT3-ITD突变阳性及突变阴性患者的白细胞计数无显著的统计学意义，但FLT3-TKD突变阳性患者的白细胞计数有高于突变阴性患者的趋势（P=0.067）。FLT3-TKD突变阳性及突变阴性患者血小板计数亦无显著的统计学意义，但FLT3¯ITD突变阳性患者的血小板计数也有高于突变阴性患者的趋势（P=0.081）。

2.3 ALL不同亚型中FLT3突变的比较

FLT3-ITD在T-ALL患者中的发生率为6.9%，高于在其他亚型中的发生率；FLT3-TKD在T-ALL患者中的发生率为10.3%，高于其他亚型；但由于例数较少均不具有统计学差异。总体而言，FLT3突变在T-ALL患者中的发生率为17.2%，在其他亚型中的发生率为5.1%，差异有显著的统计学意义（表2，p＜0.001）。

表1 FLT3突变阳性与突变阴性患者的临床资料

表2 FLT3突变在A L L不同亚型中的发生情况

3 讨论

FLT3基因突变与急性白血病的发生密切相关。近年，一系列针对FLT3突变的小分子抑制物已被研发出来，其中许多已处于临床试验阶段[3]。一些临床试验结果显示，联合FLT3抑制剂有望提高AML的疗效[14-15]。以往关于FLT3突变的研究多集中于AML，而较少关注ALL患者中的FLT3突变。目前发现，伴有FLT3突变的ALL患者主要为婴幼儿[16-17]。在对ALL-REZ-BFM（Acute Lymphoblastic Leukemia Relapse Berlin-Frankfurt-Münster，复发急性淋巴细胞白血病-柏林-法兰克福-明斯特）研究组134例首次复发的ALL患者的研究中，Wellmann等[18]发现了3例FLT3突变的患者，其中2例为FLT3-TKD，1例为FLT3-ITD。Elyamany等[19]在77例ALL患者中检测出2例（2.6%）FLT3突变，其中FLT3-ITD和FLT3-TKD各1例（1.3%）。另外，Grossmann等[20]对90例T-ALL患者进行了FLT3-ITD（2.2%）和FLT3-TKD（1.1%）的检测。

本研究检测了我院147例ALL患者的FLT3基因突变情况，发现FLT3突变在ALL患者中的总发生率为7.5%，其中FLT3-ITD突变的发生率为2.0%，FLT3-TKD突变的发生率为5.5%。Chang等[21]发现，441例儿童ALL患者中有9例（2%）为FLT3突变阳性，AML患者中ITD突变的发生率较高，而ALL患者中的TKD突变更普遍，这与我们的研究结果相似。进一步分析发现，FLT3突变在TALL患者中的发生率为17.2%，在其他亚型中的发生率为5.1%，差异具有显著的统计学意义（p＜0.001）。这提示，FLT3基因突变在T-ALL患者的发病过程中发挥更重要的作用。有研究[22]发现，携带FLT3基因突变的ALL患者与携带FLT3基因突变的AML患者的临床特征有差异，这主要表现在发病初期的白细胞计数上，携带FLT3基因突变的AML患者外周血白细胞计数往往较高；但本研究中携带FLT3-ITD突变的ALL患者的白细胞计数并不高，或与本研究入组的病例资料较少有关。

本研究检测了ALL患者中FLT3基因突变的发生率，并发现了FLT3突变ALL患者有别于AML患者的一些临床特点。虽然FLT3突变对ALL患者预后的意义还需更大系列的研究来探究，但本研究结果提示部分ALL患者存在FLT3突变，FLT3抑制剂或将用于治疗ALL，并使患者获益。

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