HIF-1α和 MMP9促进浸润性乳腺癌中血管生成

王丹娜 朱 博 武世伍 承泽农雷 洋

（蚌埠医学院第一附属医院病理科；蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 233000）

HIF-1α和 MMP9促进浸润性乳腺癌中血管生成

王丹娜 朱 博 武世伍 承泽农*雷 洋

（蚌埠医学院第一附属医院病理科；蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 233000）

目的 探讨浸润性乳腺癌（infiltrating breast carcinoma，IBC）组织中HIF-1α和MMP9的表达情况与血管生成的关系及其临床病理意义。方法 采用免疫组织化学 ElivisionTMplus法检测 115例 IBC组织和 20例乳腺纤维腺瘤中 HIF-1α和MMP9的表达情况以及微血管密度（microvessel density，MVD）。结果 在IBC组织和乳腺纤维腺瘤中HIF-1α和MMP9的阳性表达率分别为60.9%、62.6%和10%、10%，差异均有统计学意义；HIF-1α和 MMP9蛋白的表达水平与肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移与否、临床分期及Her-2表达均有关；MVD计数与肿瘤患者是否有淋巴结转移、临床分期以及 Her-2表达均相关；且 HIF-1α、MMP9蛋白的表达与MVD计数相互之间均呈正相关性。结论 HIF-1α和 MMP9的过表达促进了IBC的发展、侵袭和转移，MVD计数升高进一步促进IBC的转移过程；联合检测HIF-1α、MMP9和 MVD对 IBC患者的进展及预后判断有重要意义。

乳腺肿瘤；HIF-1α；MMP9；微血管密度；预后

乳腺癌在所有恶性肿瘤中排第二位，是女性最常见的恶性肿瘤，每年因其死亡的人数在女性肿瘤占第一位［1］。转移和复发是其导致患者死亡的主要原因。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是一种转录因子，当缺氧时，广泛表达于人体多种组织，在肿瘤组织中也普遍表达，是肿瘤细胞为适应缺氧环境时细胞转录基因，其表达增高参与了肿瘤的侵袭、发展、转移及血管生成等多种生物学行为［2］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一组金属离子依赖的蛋白酶，可以降解细胞外基质中的各种蛋白，其活性程度与肿瘤的侵袭、转移过程密切相关。MMP9是MMPs家族中的一员，几乎能降解细胞外基质的所有成分而备受关注。近年来的研究表明［3-4］，由缺氧介导的HIF-1α和 MMPs表达增加可能与肿瘤的血管生成具有一定的关系。目前最常用的反映血管生成的指标——微血管密度（microvessel density，MVD），与肿瘤的扩散、转移密切相关。MVD通常通过 CD34阳性表达的小管腔来计数。本研究通过免疫组织化学方法检测115例乳腺浸润性癌（infiltrating breast carcinoma，IBC）患者中 HIF-1α、MMP9和 CD34蛋白的表达，分析 HIF-1α和MMP9蛋白表达与MVD计数之间的关系，并探讨它们与IBC浸润、转移及预后的关系。

材料和方法

1.一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院病理科2007年1月至12月存档石蜡包埋 IBC组织标本115例（术前未行放、化疗）和纤维腺瘤组织标本20例。所有病例均经本院病理诊断为IBC，均有完整的临床和病理资料。临床资料包括年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移与否及临床病理分期（见表 1）。其中临床病理分期是根据 UICC和 AJCC最新分期标准进行。20例乳腺纤维腺瘤组织标本设为对照组，中位年龄50.6岁。

2.试剂

鼠抗人 HIF-1α单 克 隆 抗 体（产品 编 号：SC53546）购自美国 Santa Cruz公司；鼠抗人 MMP9单克隆抗体（克隆号：15W2）购自北京中杉生物技术有限公司；鼠抗人 CD34单克隆抗体 （克隆号QBEnd／10）、Elivision试剂盒以及 DAB显示试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

3.实验方法

所有标本均经 10%中性甲醛溶液固定，组织以石蜡包埋，4 μm厚连续切片、烤干，接着于二甲苯溶液及不同的浓度梯度乙醇溶液中脱蜡至水洗，采用免疫组织化学 ElivisionTMplus法，所有试剂均按试剂盒说明步骤进行。利用已知阳性片作对照，以 PBS液代替一抗作为空白对照。

4.结果判定

HIF-1α、MMP9均以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性；ER、PR均以细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性；Her-2以细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。根据细胞的染色强度和范围来综合计分，染色强度分为：无色，0分；淡黄色，1分；黄色，2分；棕黄色，3分；范围分为：阳性细胞为＜10%，1分；11%～50%，2分；51% ～75%，3分；＞75%，4分。具体计分方法见相关文献［5］，若积分≥3分为阳性，＜3分为阴性。CD34以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，MVD通过CD34阳性表达的小管腔来计数，随机计数10个中倍视野中的小管腔数，计数方法见参考文献［6］。免疫组织化学结果由两位病理医师通过独立双盲法判定。

5.统计分析

采用 SPSS17.0统计软件包进行数据分析。在IBC组织中，HIF-1α、MMP9蛋白的表达以及MVD计数与纤维腺瘤组织、各临床及病理因素的相关性采用X2、spearman等级相关以及t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.HIF-1α在 IBC的表达及其与临床病理因素的关系

在对照组中，HIF-1α蛋白的阳性表达率为10%（2／20），在 IBC组织中，HIF-1α蛋白的阳性表达率为60.9%（70／115）（图1A、图1B），两组之间差异有显著性（P＜0.01）；HIF-1α蛋白的表达与IBC组织的分化程度、淋巴结转移、临床分期及 Her-2的表达均相关（表1）。

2.MMP9在 IBC中的的表达与临床病理因素的关系

MMP9蛋白在对照中的阳性表达率为10%（2／20），在IBC组中的阳性表达率为 62.6%（72／115）（图1C、图1D），两组之间差异有显著性（P＜0.01）；MMP9蛋白的表达率与 IBC组织的分化、淋巴结转移及临床分期均有关（全部 P＜0.05）（表 1），且MMP9的表达与 Her-2的表达呈正相关（P＜0.05）（表2）。

3.MVD与临床病理因素的关系

MVD计数与患者的肿瘤大小、分化程度及 PR的表达等均无关（P＞0.05，表 1）；在淋巴结转移组中，MVD的计数显著高于淋巴结未转移组（图1E、图1F），且 MVD计数高低与临床分期及 ER的表达有关，差异均有显著性（P＜0.05）。

4.IBC组织中 HIF-1α、MMP9蛋白的表达与 MVD计数之间的关系

MVD计数与HIF-1α蛋白的表达呈正相关关系（r＝0.522，P＜0.001）；MVD计数与MMP9蛋白的表达呈正相关关系（r＝0.492，P＜0.001）（表2）。

图1 HIF-1α、MMP9和MVD在对照组和IBC组中的表达和计数情况。A：在对照组中HIF-1α的阴性表达（Elivision100×）；B：在低分化IBC组织中 HIF-1α的阳性表达，主要定位于细胞浆和膜（Elivision100×）；C：对照组中 MMP9的阴性表达（Elivision100×）；D：在低分化IBC组织中 MMP9的阳性表达，主要定位于胞浆和膜（Elivision400×）；E：在低分化IBC中的低MVD计数（Elivision100×）；F：在低分化IBC中的高 MVD计数（Elivision100×）Fig.1 Expression of HIF-1αand MMP9 and the score of MVD in TBC and CON.A：negative staining of HIF-1αin CON（Elivision100×）；B：positive staining of HIF-1αin cytoplasm and membrane of poorly grade IBC（Elivision100×）；C：negative staining of MMP9 in CON（Elivision100×）；D：positive staining of MMP9 in cytoplasm and membrane of poorly grade IBC（Elivision400×）；E：the low score of MVD in poorly grade IBC（Elivision100×）；F：the high score of MVD in poorly grade IBC（Elivision100×）

表1 IBC组织中 HIF-1α、MMP9表达和 MVD计数与临床病理因素的关系Table 1 correlation of HIF-1αand MMP9 expression and the score of MVD with clinicopathollgic characteristics in IBC

续表

表2 IBC组织中HIF-1α、MMP9、MVD、ER、PR和Her-2各因素之间的相互关系Table 2 the expression of HIF-1αand MMP9 and ER and PR and cerbB-2 and the score of MVD and their relationship in IBC

讨 论

缺氧和缺血是实体肿瘤的一个基本特征，缺氧不仅与肿瘤的发生发展有关，同时也是肿瘤对治疗产生耐受性的原因之一［7］。HIF-1是由 α亚基和 β亚基构成的异源二聚体，而 HIF-1α对缺氧反应极其敏感，是氧反应亚基，只与 O2代谢有关。该基因位于人 14号染色体，并编码 826个氨基酸。当细胞缺氧时，HIF-1α在细胞内表达增高，通过诱导多种基因表达，使肿瘤细胞适应缺氧的微环境；或可以通过促进新生血管形成及调控多种靶基因表达以逃避相对缺氧的微环境，从而促进了肿瘤的生长、侵袭和转移［8］。本研究通过免疫组织化学方法检测115例浸润性乳腺癌（infiltrating breast cancer，IBC）组织和20例乳腺纤维腺瘤组织中 HIF-1α蛋白的表达，发现 IBC组织中 HIF-1α蛋白的表达明显高于乳腺纤维腺瘤组织，差异有显著性；并且肿瘤的分化越差，其阳性表达率也越高，差异有显著性；淋巴结转移组的HIF-1α蛋白表达水平显著高于淋巴结无转移组；临床分期越高，HIF-1α蛋白阳性表达率越高，提示 HIF-1α蛋白表达增高与IBC的发生、发展及浸润、转移密切相关，与其他学者的研 究 结 果 一 致［5，9］。

生理状态下，MMP9可以降解任何细胞外基质，参与胚胎发育及创伤修复等功能；异常时，MMP9通过破坏局部组织的细胞外基质及基底膜屏障，促进肿瘤的生长、侵袭及转移。本研究发现，MMP9蛋白阳性表达率高的肿瘤具有分化差、易淋巴结转移和临床 分期高 等特点，与以往 的研究结 果 一致［9-10］。众所周知，当肿瘤组织生长到 1mm3时，就会通过诱导原有的内皮细胞通过芽生或通过诱导内皮前体细胞分化成血管内皮细胞后再形成新的血管，以缓解自身的缺血缺氧。微血管密度（microvessel density，MVD）是反映血管活性中最常用的一种指标，本研究采用 CD34抗体来标记微血管密度，发现，在发生淋巴结转移的IBC患者中，其 MVD的计数明显高于未发生淋巴结转移的患者，差异有统计学。MVD的计数与患者的年龄、肿瘤大小等无关。

Spearman相关分析显示，IBC组织中微血管的形成与HIF-1α及 MMP9的表达呈正相关关系；HIF-1α蛋白的表达与 MMP9蛋白的表达亦呈正相关关系。且MVD、HIF-1α及MMP9的表达都与 Her-2的表达呈正相关性。由此我们可以推测，随着肿瘤的快速生长及发展，肿瘤组织缺血缺氧越来越明显，而缺血缺氧的刺激可以促进肿瘤细胞内的HIF-1α的活化，通过上调肿瘤组织的MMP9的表达，破坏和重建细胞外基质，并促进血管的形成，以上步骤最终导致肿瘤组织易于侵袭及转移，使得患者的生存期更短，预后更差。此外有研究表明［11］，Her-2的过表达可以激活 PI3K／Akt信号通路，从而增强 HIF-1α的表达，使肿瘤细胞更加耐受缺血缺氧。

综上所述，HIF-1α基因高表达是 IBC细胞耐受缺血、缺氧的分子基础，而MMP9的表达异常增高可能是促进 IBC血管生成，从而进一步发生侵袭、转移的关键事件。因此，联合检测 HIF-1α、MMP9和MVD计数情况对于评估 IBC患者的转移和预后有一定的预测价值。

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HIF-1α and MMP9 promote angiogenesis in infiltrating breast carcinoma

Wang Danna，Zhu Bo，Wu Shiwu，Cheng Zenong*，Lei yang
（Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；Department of Pathology，Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China）

Objective To investigate the expression levels of HIF-1α and MMP and microvessel density（MVD）in infiltrating breast carcinoma（IBC）and evaluate their clinicopathological significance.Methods MVD scores marked by CD34 and the expression of HIF-1α and MMP9 were examined by immunohistochemistry in 115 specimens of IBC tissues and 20 specimens of breast fibroadenoma tissues.Results The positive rates of HIF-1α and MMP9 in IBC and breast fibroadenoma were 60.9%，62.6%and 10%，10%，respectively.The expression of HIF-1α and MMP9 was significantly related to grades of tumor，lymph node metastasis，pTNM stages，and Her-2 expression.The score of MVD was significantly related to lymph node metastasis，pTNM stages，and Her-2 expression.There was a positive relationship between HIF-1α and MMP9 expression and MVD score.Conclusion The overexpression of HIF-1α and MMP9 may promote IBC progression，invasion and metastasis，and the high score of MVD may further promote IBC metastasis.The combined detection of HIF-1α，MMP9，and MVD might be a useful approach in predicting the progression and prognosis of IBC.

Breast neoplasms；HIF-1α；MMP9；Microvessel density；Prognosis

R732.9

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.006

2015-03-15

2015-09-11

王丹娜，女（1988年），汉族，助理实验师

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：961219269＠qq.com