大孔树脂纯化桦褐孔菌多酚及其成分分析

董 琦，高 珊，曹龙奎,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

大孔树脂纯化桦褐孔菌多酚及其成分分析

董 琦1，高 珊1，曹龙奎1,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

采用大孔吸附树脂对桦褐孔菌多酚进行纯化，并采用高效液相色谱-电喷雾-质谱（high performance liquid chromatography-electrosprary ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS）技术对桦褐孔菌多酚纯化物进行分离鉴定分析。实验结果表明，D101树脂不仅静态吸附量、吸附率最大，且解吸性能优良，适合分离纯化桦褐孔菌多酚。最佳纯化工艺条件为上样质量浓度1.0 mg/mL、上样流速1.0 mL/min、洗脱液乙醇溶液体积分数70%、洗脱流速1.0 mL/min，在此条件下，其纯度由16.52%提高到了49.77%；根据HPLC-ESI-MS检测分析结果推测桦褐孔菌多酚中含有9 种物质，分别为无色花色素、花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、仙茅苷、像黄素-3-O-己糖苷、7-木糖苷儿茶酚、雪胆素乙、桔皮素、儿茶素、芦丁。

大孔树脂；纯化；桦褐孔菌多酚；成分分析

桦褐孔菌（Inonotus obliquus），是主要分布在北欧、俄罗斯、中国北部等高寒地区白桦树上的一种珍稀的药用真菌，对肿瘤、心脏病、糖尿病、胃病及艾滋病等疾病有显著疗效且没有明显的不良反应[1]。桦褐孔菌中主要化学成分包括叶酸衍生物、多糖类化合物、芳香物质、多酚类化合物、三萜类化合物及生物碱类化合物等[2-3]，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、防治糖尿病等多种生理功能，其中含有的多酚类化合物是抗氧化作用的主要物质，具有广泛的开发价值和应用前景[4-13]。

大孔吸附树脂是一种理化性质稳定，不溶于酸、碱、有机溶剂的高分子吸附剂。大孔吸附树脂的纯化原理是：大孔吸附树脂的吸附作用主要依靠分子间的范德华力，运用大量的比表面积进行吸附，从而使化合物被洗脱剂分开达到分离纯化的目的[14]。大孔吸附树脂按极性大小分为极性、中极性、非极性树脂三类，一般极性较大的分子适合在中极性树脂中纯化，极性较小的分子适合在非极性树脂中纯化。由于大孔树脂的独特的三维空间立体孔结构而使得其孔径和比表面积都比较大，因此具有吸附量大、吸附速度快、高稳定性、高选择性、易解吸、易再生处理、节省资源费用等诸多优点[15]。

目前，关于纯化桦褐孔菌多酚及对桦褐孔菌多酚的鉴定分析的报道较少。本实验比较5 种大孔树脂对桦褐孔菌多酚吸附解吸性能，从中选出一种适合分离纯化桦褐孔菌多酚的树脂，并确定其最佳工艺条件。采用高效液相色谱-电喷雾-质谱（high performance liquid chromatography-electrosprary ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS）技术对桦褐孔菌多酚纯化物进行初步分离鉴定分析，为桦褐孔菌资源的开发及利用提供一条新途径，提高桦褐孔菌的利用率及综合效益，同时为进一步对桦褐孔菌的研究提供了理论依据和参考，为有效地寻找桦褐孔菌多酚中抗氧化物质提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦褐孔菌购于黑龙江大兴安岭漠河洪峰山特产加工经销有限公司，经40 ℃烘干粉碎过40目筛；没食子酸标准品 北京科奥科技有限公司；福林酚 天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇、无水碳酸钠（均为分析纯）、甲醇（色谱级） 国药集团化学试剂有限公司；AB-8、D101、X-5、NKA-9大孔树脂 天津市大茂化学试剂厂；HP-20大孔树脂 北京绿百草科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；EG720KG4-NA美的微波炉 广东美的厨房电器制造有限公司；AR2140电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司（上海）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器有限责任公司；RE-5298旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HL-2D型定时数显恒流泵 上海精科实业有限公司；SBS-16OF电脑自动部分收集器 上海精科实业有限公司；HZQ-Q智能型全温振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；Coolsafe110-4冷冻干燥机 丹麦LaboGene公司；YDA388型HPLC-MS系统（含二元高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源、Masslynx V4.1色谱工作站） 美国Waters公司；XS205分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；移液器 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌多酚粗提液的制备

精确称取一定量的桦褐孔菌粉末以料液比1∶50浸于体积分数为50%的乙醇溶液中，在微波功率为560 W条件下进行微波辅助提取180 s，抽滤，将粗提液于50 ℃旋转蒸发器中浓缩，置于4 ℃保存，使用时配成所需要的质量浓度。

1.3.2 桦褐孔菌多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法测定桦褐孔菌中多酚含量[16]。以没食子酸为标准品，以吸光度为纵坐标，以没食子酸质量浓度为横坐标绘制标准曲线：y=71.568x＋0.012 5（R2=0.999 0）。根据式（1）计算桦褐孔菌多酚含量。

式中：C为桦褐孔菌多酚含量/（mg/mL）；A为吸光度；N为稀释倍数。

1.3.3 桦褐孔菌多酚纯度的测定

取一定体积的粗提液与纯化液，冷冻干燥后，称取一定质量的粗提物与纯化物，复溶。根据式（2）计算桦褐孔菌多酚纯度。

式中：P为桦褐孔菌多酚纯度/%；C为桦褐孔菌多酚含量/（mg/mL）；V为复溶的溶液体积/mL；m为冻干后质量/mg。

1.3.4 大孔树脂的预处理

室温条件下，将HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8这5 种树脂用无水乙醇溶液浸泡24 h，充分溶胀后，倒除浮在表面上的杂物及碎片，用无水乙醇冲洗至不再浑浊，用蒸馏水将树脂洗至无醇味。用5% HCl溶液浸泡树脂8 h，用蒸馏水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡树脂8 h，后用蒸馏水洗至中性，滤纸吸干水分备用[17]。

1.3.5 静态吸附与解吸实验

将预处理过的HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8这 5 种树脂，分别精确称取1.00 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入质量浓度为1 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液20 mL，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h进行吸附，充分吸附后，过滤，测定滤液中桦褐孔菌多酚的质量浓度，按式（3）、（4）计算各树脂的吸附量与吸附率。将充分吸附后5 种树脂用大量蒸馏水冲洗至树脂表面无提取液残留，用滤纸吸干水分后，加入体积分数为70%乙醇溶液30 mL，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h，进行充分解吸后，过滤，测定滤液中桦褐孔菌多酚的质量浓度，按（5）计算解吸率。

式中：C0为吸附前桦褐孔菌多酚粗提液的质量浓度/（mg/mL）；C1为吸附后滤液中桦褐孔菌多酚的质量浓度/（mg/mL）；V1为粗提液体积/mL；m1为树脂的质量/g；C2为解吸后滤液中桦褐孔菌多酚的质量浓度/（mg/mL）；V2为洗脱液体积/mL。

1.3.6 大孔树脂静态吸附动力学曲线

将预处理过的HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8这 5 种树脂，分别精确称取1.00 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入质量浓度为1 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液20 mL，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h进行吸附，每1 h吸取一定量的上清液测定桦褐孔菌多酚的质量浓度，绘制静态吸附动力学曲线。根据吸附率、解吸率及吸附动力学曲线选出其中最适合纯化桦褐孔菌多酚的大孔树脂型号进行后续实验。

1.3.7 桦褐孔菌多酚上样质量浓度对吸附效果的影响

称取预处理过的D101大孔吸附树脂5 份各1.00 g，于250 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h进行吸附，充分吸附后，过滤，测定滤液中桦褐孔菌多酚质量浓度，计算吸附率。

1.3.8 洗脱液体积分数对解吸效果的影响

称取预处理过的D101大孔吸附树脂6份各1.00 g，于250 mL具塞锥形瓶中，加入质量浓度为1.0 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液20 mL，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h进行吸附，充分吸附后，过滤，测定滤液中桦褐孔菌多酚质量浓度，将滤出的树脂用大量蒸馏水冲洗至树脂表面无提取液残留，用滤纸吸干水分后，加入30 mL体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，避光密封置于25 ℃恒温摇床上进行振荡，在100 r/min条件下振荡12 h，进行充分解吸后，过滤，测定滤液中桦褐孔菌多酚的质量浓度，计算解吸率。

1.3.9 上样流速对吸附效果的影响

将处理过的D101大孔吸附树脂湿法装柱，将质量浓度为1.0 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液，分别以2.0、1.5、1.0、0.5 mL/min的流速进行动态吸附实验，每隔100 mL取1 mL测桦褐孔菌多酚含量，以体积为横坐标、桦褐孔菌多酚含量为纵坐标绘制曲线，研究上样流速对吸附效果的影响。

1.3.10 动态洗脱曲线

将处理过的D101大孔吸附树脂湿法装柱，选取质量浓度为1.0 mg/mL的桦褐孔菌多酚粗提液以1.0 mL/min的流速上样得到的树脂柱，洗脱液为体积分数70%的乙醇溶液，洗脱流速为1.0 mL/min，收集洗脱液并每10 mL收集一管测桦褐孔菌多酚质量浓度，以洗脱体积为横坐标、桦褐孔菌多酚含量为纵坐标绘制曲线。

1.3.11 HPLC-ESI-MS鉴定分析桦褐孔菌多酚

采用H P L C-M S系统对桦褐孔菌多酚纯化物进行检测，流动相为A：0.1%甲酸溶液、B：甲醇；流速为0.5 mL/min；色谱柱：Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；进样量：5 μL；梯度洗脱程序如表1所示。

表1 HPLC-ESI-MS梯度洗脱条件Table1 Gradient elution conditions for HPLC-ESI-MS

2 结果与分析

2.1 5 种大孔树脂对桦褐孔菌多酚的静态吸附与解吸性能

表25 种大孔吸附树脂对桦褐孔菌多酚的静态吸附与解吸性能Table2 The adsorption and desorption properties of 5 kinds of resin ffoorr Inonotus obliquus polyphenols

由表2可知，D101树脂的吸附量及吸附率最大，其次分别为AB-8、HP-20、NKA-9、X-5。但是要作为纯化桦褐孔菌多酚的树脂不仅要求吸附率高，并且还要要求其解吸率优秀才可以。解吸率最高的为X-5树脂，其次分别为D101、AB-8、HP-20、NKA-9。D101型树脂吸附率最高，解吸率也很高，适合作为纯化桦褐孔菌多酚的树脂。X-5虽然解吸率最高，但是其吸附量及吸附率都很低，所以不适合纯化。其他型号的树脂的吸附率及解吸率都不如D101树脂。

2.2 静态吸附动力学曲线

图1 静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetic curves

由图1可以看出，HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8这5种树脂对桦褐孔菌多酚的吸附量随着吸附时间的延长先增加而后趋于平衡，4～5 h基本达到吸附平衡，属快速吸附型树脂，且这5 种树脂对桦褐孔菌多酚的吸附量存在一定的差异，D101静态饱和吸附量为12.05 mg/g，其次为AB-8，吸附量为10.96 mg/g，X-5吸附量最低，为9.28 mg/g。这说明不同的大孔吸附树脂对桦褐孔菌多酚的吸附有选择性，通过对比HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8这5 种树脂的理化特性发现这可能是与树脂的极性、比表面积和及平均孔径大小有关系，可能只有比表面积和平均孔径都较大有利于桦褐孔菌多酚的扩散及吸附[18]。根据以上实验结果分析，综合吸附量、吸附率、解吸率及动态吸附曲线考虑，选择D101大孔吸附树脂来进行纯化桦褐孔菌多酚。

2.3 桦褐孔菌多酚上样质量浓度对吸附效果的影响

图2 桦褐孔菌多酚上样质量浓度对吸附效果的影响Fig.2 Infl uence of sample concentration on the adsorption effi ciency

由图2可知，当桦褐孔菌多酚上样质量浓度较低时，吸附量较小，这说明D101树脂并未吸附饱和，随着桦褐孔菌多酚质量浓度不断增加，吸附量也逐渐增加。当质量浓度为1.0 mg/mL，吸附量达到平衡，这说明D101树脂已基本吸附饱和。因此，在一定范围内提高桦褐孔菌多酚质量浓度，能够增加树脂的使用率，但是当质量浓度过高时，桦褐孔菌多酚上样液容易产生沉淀和混浊，对树脂造成污染而导致堵塞[19]。因此，选择桦褐孔菌多酚上样质量浓度为1.0 mg/mL较为合适。

2.4 洗脱液体积分数对解吸效果的影响

图3 洗脱液体积分数对解吸效果的影响Fig.3 Effect of eluent concentration on the desorption effi ciency

考虑到安全及生产成本，本研究选择乙醇为洗脱液。从图3可以看出，当洗脱液体积分数低于70%时，解吸率随着洗脱液体积分数的增加而增大，当洗脱液体积分数为70%时，解吸率达到最大值，继续增加洗脱液体积分数，解吸率却呈下降趋势。这可能是由于桦褐孔菌多酚凭借氢键的作用力吸附在D101大孔树脂上，随着洗脱液体积分数的提高，加大了对氢键的断裂作用，所以解吸率随着升高[20]。当洗脱液体积分数超过70%后，由于洗脱液与桦褐孔菌多酚极性差异变大导致多酚得不到充分的溶解，所以解吸率呈下降趋势。因此，选择洗脱液体积分数为70%较为合适。

2.5 上样流速对吸附效果的影响

图4 上样流速对吸附效果的影响Fig.4 Effect of sample loading fl ow rate on the adsorption effi ciency

由图4可知，随着桦褐孔菌多酚流出液的增多，流出液中桦褐孔菌多酚质量浓度也越来越大，这说明D101大孔树脂对桦褐孔菌多酚的吸附率正逐渐降低。上样流速越慢，流出液中桦褐孔菌多酚质量浓度越低，有利于桦褐孔菌多酚被树脂吸附；相反，上样流速越快，流出液中桦褐孔菌多酚质量浓度越高，造成这样的原因是流速过高，桦褐孔菌多酚还未来得及进行吸附就被后加入的液体冲洗下来，从而导致吸附量低，但上样流速过慢会导致操作时间久，从而影响生产效率[21]。因此，选择上样流速为1.0 mL/min较为合适。

2.6 动态洗脱曲线

图5 动态洗脱曲线Fig.5 Dynamic desorption curve

由图5可以看出，在动态洗脱条件下，桦褐孔菌多酚在D101树脂上极易被洗脱下来。桦褐孔菌多酚的洗脱峰相对集中，无拖尾现象。当桦褐孔菌多酚洗脱液体积为80～200 mL时，桦褐孔菌多酚含量最高，合并桦褐孔菌多酚洗脱液浓缩后，冷冻干燥，测其纯度为49.77%，较纯化前的纯度（16.52%）提高了2 倍左右。

2.7 HPLC-ESI-MS鉴定分析桦褐孔菌多酚

图6 桦褐孔菌多酚纯化物的HPLC-ESI-MS总流离子图Fig.6 HPLC-ESI-MS total ion current chromatogram of polyphenols purifi ed from Inonotus obliquus

图7 桦褐孔菌多酚纯化物HPLC-ESI-MS离子选择质谱图Fig.7 Mass spectra of HPLC-ESI-MS of polyphenol purifi ed from Inonotus obliquus under selected ion monitoring mode

通过HPLC-ESI-MS检测分析，结合一些参考文献[22-26]，根据图6、7中的m/z、出峰时间及高分辨质谱检测结果进行初步判断，虽然不够准确，但是由于桦褐孔菌多酚类物质的成分组成复杂，大多采用这种方法进行判断，图7A～I分别为无色花色素、花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、仙茅苷、像黄素-3-O-己糖苷、7-木糖苷儿茶酚、雪胆素乙、桔皮素、儿茶素、芦丁，还有很多种物质无法辨别，有待于进一步分析研究。

3 结 论

HP-20、X-5、D101、NKA-9、AB-8共5种大孔树脂中，D101大孔树脂最适合分离纯化桦褐孔菌多酚，其纯化桦褐孔菌多酚的最佳工艺条件为：上样质量浓度1.0 mg/mL、上样速率1.0 mL/min、洗脱液乙醇溶液体积分数70%，洗脱流速1.0 mL/min。此条件下制得的桦褐孔菌多酚纯化物，纯度为49.77%，比纯化前（16.52%）提高3 倍；结合桦褐孔菌多酚的HPLC-ESI-MS分析结果与相关文献报道，推测桦褐孔菌多酚中含有9 种物质，分别为无色花色素、花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、仙茅苷、像黄素-3-O-己糖苷、7-木糖苷儿茶酚、雪胆素乙、桔皮素、儿茶素、芦丁。

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Purifi cation of Polyphenols from Inonotus obliquus by Macroporous Resin and Its Component Analysis

DONG Qi1, GAO Shan1, CAO Longkui1,2,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China)

The crude polyphenol extract from Inonotus obliquus was purified by macroporous resin adsorption and the purifi ed compounds were identifi ed by high performance liquid chromatography-electrosprary ionization-mass spectrometry (HPLC-ESI-MS). The results showed that D101 resin was suitable for the purifi cation of polyphenols from Inonotus obliquus due to the maximum static adsorption capacity and rate, and excellent desorption performance. The optimal conditions for the purifi cation process were determined as follows: the sample containing 1.0 mg/mL of polyphenols was loaded at a fl ow rate of 1.0 mL/min followed by elution with 70% aqueous ethanol at a fl ow rate of 1.0 mL/min. Under these conditions, the purity of polyphenols was increased from 16.52% to 49.77%. HPLC-ESI-MS analysis showed that 9 individual polyphenols were purified from Inonotus obliquus including leucoanthocyanidins, astilbin, curculigoside, quercetin-3-O-glycoside, catechin-7-xyloside, cucurbitacinⅡb, tangeretin, c-atechin, and rutin.

macroporous resin; purifi cation; Inonotus obliquus polyphenol; component analysis

TS202.3

A

1002-6630（2015）22-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201522024

2015-03-23

黑龙江省教育厅成果产业化项目（1252CGZH13）

董琦（1990—），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail：305162016@qq.com

*通信作者：曹龙奎（1965—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工。E-mail：caolongkui2013@163.com