脂肪酸对酿酒酵母酒精耐性的影响

王 川，罗惠波，黄 丹

（四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000）

脂肪酸对酿酒酵母酒精耐性的影响

王 川，罗惠波，黄 丹

（四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000）

研究几种不同脂肪酸对酿酒酵母在存活率、生长速率和发酵方面的酒精耐性的影响。结果表明：培养基中添加两种不饱和脂肪酸（棕榈油酸和油酸）能显著增加酵母菌在酒精冲击下的存活率，其中棕榈油酸的效应更强。同时这些存活的酵母菌在含酒精培养基上的生长速率也比普通酵母菌更快，而两种饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）在提高酵母菌存活率和生长速率方面几乎无贡献。同时在添加相同浓度不饱和脂肪酸的条件下，培养至稳定期的酵母菌比对数期酵母菌具有更高的存活率和更好的生长速率。但在发酵方面，添加短链脂肪酸（棕榈油酸和棕榈酸）能够使酵母菌发酵达到较高的酒精体积分数，这个结果与酵母菌生长耐酒精性的结果不一致，表明酵母菌生长和发酵的酒精耐性机制是不同的。

酿酒酵母；脂肪酸；耐酒精性；生长；发酵

利用发酵法生产酒精，获得高酒精含量一直是生产所追求的目标，但是当酒精在培养基中累积到一定浓度时，会对酵母菌细胞产生有毒效应，从而影响发酵。酵母菌耐酒精的生化机理十分复杂，有多种基因控制着酵母菌耐酒精的特性[1]，而细胞中的许多组分也与酵母菌耐酒精能力有密切的关系，如麦角固醇、脂肪酸、质膜ATP酶、冲击蛋白和海藻糖[2-5]等，对这些影响因素的生化机理方面的研究目前还有许多未知之处。研究表明，细胞膜是酒精对酵母菌毒害作用的一个主要目标，酒精能使酵母菌细胞膜流动性改变，并导致膜完整性的下降[6]，而酵母菌细胞膜的流动性主要与体内的脂肪酸密切相关[7]，已有报道表明调节脂肪酸的种类、含量和比例能提高酵母菌在酒精冲击下的存活率[8-11]，在此基础上，本实验通过在培养基中加入酵母菌中存在的几种主要脂肪酸，研究酵母菌在存活率、生长和发酵方面的酒精耐性，探讨脂肪酸对酵母菌耐酒精能力的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SCLG091由酿酒生物技术及应用四川省重点实验室保存。

1.1.2 培养基

YPD培养基（g/L）：酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20；生长培养基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨3、酵母提取物10；发酵培养基（g/L）：葡萄糖250、酵母抽提物3、蛋白胨3、(NH4)2SO41、KH2PO40.5、MgSO40.36、CaCl20.28。

1.1.3 试剂

棕榈油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸，均为国产分析纯，并按文献[10]方法溶解于培养基；0.1 g/100 mL碱性美蓝染色液：0.1 g亚甲基蓝，溶于100 mL蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 酒精耐受性实验

将酿酒酵母接于YPD斜面培养基活化48 h，然后接种在含50 mL YPD液体培养基的250 mL烧瓶中，每个烧瓶中分别加入不同浓度（0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 mmol/L）的几种脂肪酸（棕榈油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸），以30 ℃、150 r/min培养，分别取培养至指数期和稳定期的酵母菌细胞离心后以无菌水洗涤两次，重悬于含有14%乙醇的YPD培养基中，以不加脂肪酸的酵母菌培养液作为对照，30 ℃、100 r/min培养2 h，从培养液中取样，涂布YPD平板，于30 ℃培养72 h后以美蓝染色法计数，计算实验组酵母菌存活率与对照组酵母菌存活率之差并作图。

1.2.2 酒精发酵实验

选取经14%酒精冲击后生长良好的酵母菌转移至生长培养基中，28 ℃、100 r/min培养24 h。然后以体积分数10%接种量将种子接入含4%酒精的200 mL发酵培养基中，置于30 ℃摇床中发酵72 h，每隔一定时间取样，测定在560 nm波长处的OD值和发酵液的酒精体积分数，以不加脂肪酸的酵母菌为对照，绘制细胞生长曲线。酒精体积分数测定方法参照文献[12]进行。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母的酒精耐受性

将酵母菌在加入不同浓度的几种脂肪酸的培养基中分别培养至指数期和稳定期后以14%酒精冲击，结果如图1所示，加入不饱和脂肪酸（棕榈油酸和油酸）的指数期酵母菌能显著提高酵母菌在酒精存在下的存活率，并且棕榈油酸的效果优于油酸。而加入饱和脂肪酸对酵母菌的耐酒精性提高有限（硬脂酸）或基本无影响（棕榈酸）（图1a）。酵母菌的耐酒精能力与不饱和脂肪酸的浓度成正相关，其中酵母菌在酒精冲击下的存活率随不饱和脂肪酸浓度的增加而增加，在浓度达到3 mmol/L时呈现饱和现象。

相比于指数期酵母菌，加入不饱和脂肪酸的稳定期酵母菌能更好地提高酵母菌的存活率（图1b），相同浓度下棕榈油酸对酵母菌的酒精耐性效果优于油酸，同时酵母菌酒精耐性随两种不饱和脂肪酸的浓度增加而增强，达到5 mmol/L时出现饱和现象，饱和浓度大于指数期酵母菌。稳定期酵母菌的酒精耐性比指数期酵母菌强，表明在稳定期的细胞的存活率可能还受别的因素影响，可能与稳定期的细胞内容物有关，例如热休克蛋白的合成等[5]。

图1 脂肪酸对指数期（a）和稳定期（b）酵母菌酒精耐受性的影响Fig.1 Effect of fatty aids on ethanol tolerance of S. cerevisiae in exponential phase (a) and stationary phase (b)

2.2 酒精发酵实验结果

按照1.2.1节实验结果，选取分别接种自指数期和稳定期（在含1 mmol/L脂肪酸培养基中培养的），经酒精冲击后生长良好的酵母菌在含4%酒精的发酵培养基中发酵，测定其生长曲线和酒精体积分数，结果见图2和图3。

图2 在含4%酒精发酵培养基中不同酵母菌的生长曲线Fig.2 The growth curves of different S. cerevisiae strains cultured in the presence of 4% alcohol

由图2可知，培养基中的乙醇会使对照组酵母菌生长的延迟期增加（约16 h），表明乙醇对酵母菌的生长具有抑制作用，与对照组酵母菌相比，经脂肪酸培养的酵母菌能不同程度地缩短酵母菌的延迟期，其中经不饱和脂肪酸培养的酵母菌能将延迟期缩短至6 h（加棕榈油酸）和7 h（加油酸），而经饱和脂肪酸培养的酵母菌对延迟期的缩短并不明显（棕榈酸为14 h、硬脂酸为16 h）。这表明在含有乙醇的培养基中，经不饱和脂肪酸培养的酵母菌比经饱和脂肪酸培养的酵母菌生长得更好，这与前述耐酒精实验的结果相一致。而对比接种自不同生长时期酵母菌的生长曲线，结果显示接种自稳定期的酵母菌比指数期酵母菌能更显著地缩短酵母菌的延迟期（4～5 h），这表明接种自稳定期的酵母菌在酒精存在条件下的生长能力强于指数期酵母菌，这个结果也与耐酒精实验结果一致。

图3 不同来源酵母菌的发酵能力Fig.3 The fermentation capacity of different S. cerevisiae strains

在发酵能力方面，由图3可知，接种自指数期和稳定期的以短链脂肪酸培养的酵母菌发酵后的酒精体积分数（棕榈油酸为11.6%，棕榈酸为11.2%）明显比对照组的酒精体积分数（9.2%）更高，而且达到最大酒精体积分数时所需发酵时间更短，分别为33 h（棕榈油酸）和48 h（棕榈酸），显示出较好的发酵酒精耐性。而以长链脂肪酸培养的酵母菌发酵酒精体积分数（油酸为9.3%，硬脂酸为9.4%）和发酵时间（油酸为56 h，硬脂酸为55 h）都接近于对照组酵母菌，没有显示出发酵的酒精耐性。这个结果与脂肪酸对酵母菌在存活率和生长速率方面的酒精耐性影响不一致，表明酵母菌生长和发酵过程的酒精耐性机制可能有所不同。

3 讨 论

在评价酵母菌酒精耐受性中，主要有存活率、生长速率、发酵性能3 个指标，本研究选取了酵母菌中主要存在的几种脂肪酸：棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和油酸[8]，从以上3 个指标方面研究脂肪酸对酵母菌酒精耐性的影响。对脂肪酸在酵母菌酒精耐性中的影响，已有的研究多集中在乙醇胁迫时酵母菌的细胞脂质构成的改变，并报道了一些互不相同的结论[8-11,13-17]，多数报道认为在酒精存在下生长的酵母菌提高了细胞中单不饱和脂肪酸的含量和不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸的比例[9,11,15-16]，但仍未建立一个完整的因果联系。本研究发现在添加了两种不饱和脂肪酸培养基中生长的酵母菌能够显著提高在酒精冲击下的存活率，而饱和脂肪酸对提高存活率几乎无贡献，这个结论与多数报道中不饱和脂肪酸对酒精耐性的作用相一致，不同之处在于棕榈油酸对酒精耐性的贡献作用大于油酸。这些在乙醇冲击下存活的酵母菌在随后的生长实验中也大致体现出了相同的趋势，即用不饱和脂肪酸培养的酵母菌在含酒精培养基中生长得更好，延迟期更短、生长速率更快。但这些酵母菌在发酵过程中的酒精耐性则有所不同，其中以短链脂肪酸（棕榈油酸和棕榈酸）培养后存活的酵母菌发酵产生了较高的酒精体积分数，体现出了相应的高酒精耐性，但以长链脂肪酸（硬脂酸和油酸）培养后存活的酵母菌并没有发酵产生更高的酒精体积分数。这个结果与存活率和生长实验的结果不一致。已有报道在生长时酒精耐性高的酵母菌株比耐性低的细胞内含有更多的短链脂肪酸（C16、C16∶1）[17]，本研究从发酵耐酒精性方面证实了这一结论。

本研究也对在脂肪酸培养基中生长至不同时期的酵母菌进行了酒精耐性实验，结果显示在添加相同浓度不饱和脂肪酸的条件下，培养至稳定期的酵母菌比对数期酵母菌具有更高的存活率和更好的生长速率，但在发酵实验中同样显示出不一致的结果：短链脂肪酸对发酵酒精耐性影响更大。已有报道表明稳定期酵母菌具有更好的抗胁迫能力，如温度、氧化剂、渗透压、乙醇[18]等，这与稳定期表达的热休克蛋白Hsp104[5]和MnSOD[19]有关，其中MnSOD在稳定期酵母菌的酒精耐性中发挥重要的作用，本研究进一步表明稳定期酵母菌在生长和发酵方面能显示出更强的酒精耐受性。

酒精作为亲脂溶剂，可溶解细胞膜中的脂质，会降低细胞膜的完整性，导致细胞膜通透性增加，引起细胞内物质的泄漏[6]。酵母菌细胞在乙醇胁迫时可通过不饱和脂肪酸以及固醇含量的增加来引起细胞膜的整体流动性增加，从而增加了酵母菌的酒精耐性[1,9-10]。细胞膜的流动性与脂肪酸的不饱和度和分子大小有关，因此本研究中在短链不饱和脂肪酸（棕榈油酸）中培养的酵母菌在存活率和生长速率方面展示了最强的酒精耐受性。酵母菌在酒精发酵过程中，由于缺氧和发酵温度的升高，不饱和脂肪酸合成受到抑制，膜流动性下降时，饱和脂肪酸可以提高膜的流动性，增强细胞膜渗透屏障，来提高酵母菌的耐乙醇能力，这也是酵母菌的耐性机制之一[8]。这可以解释本研究中在短链脂肪酸（C16）中培养的酵母菌在发酵过程中的酒精耐性更强，使得发酵后的酒精体积分数较高。不同脂肪酸对酵母菌生长和发酵的酒精耐受性的不同影响也表明在生长和发酵的不同条件下，酵母菌的耐酒精机制是不同的。对酵母菌耐酒精机制的了解还应结合基因工程和代谢工程，从分子水平加以阐释，为酵母菌的高体积分数酒精发酵提供理论基础。

[1] TEIXEIRA M C, RAROSO L R, MIRA N P, et al. Genome-wide identifi cation of Saccharomyces cerevisiae genes required for maximal tolerance to ethanol[J]. Applied Environmental Microbiology, 2009, 75(18): 5761-5772.

[2] SHAMARA S C. A possible role of trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Microbiology Letters, 1997, 152(1): 11-15.

[3] AGUILERA F, PEINADO R A, MILLAN C, et al. Relationship between ethanol tolerance, H+-ATPase activity and the lipid composition of the plasma membrane in different wine yeast strains[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 110(1): 34-42.

[4] YANG K M, LEE N R, WOO J M, et al. Ethanol reduces mitochondrial membrane integrity and thereby impacts carbon metabolism of Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Research, 2012, 12(6): 675-684.

[5] SANCHEZ Y, TAULIEN J, BORKOVICH K M. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress[J]. The EMBO Journal, 1992, 11(6): 2357-2364.

[6] STANLEY D, BANDARA A, FRASER S, et al. The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109: 13-24.

[7] van der REST M E, KAMMINGA A H, NAKANO A, et al. The plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae: structure, function, and biogenesis[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(2): 304-322.

[8] ALEXAANDRE H, ROUSSEAUX I, CHARPENTIER C. Ethanol adaptation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1994, 20(2): 173-183.

[9] MISHRA P, PRASAD R. Relationship between ethanol tolerance and fatty acyl composition of Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1989, 30(3): 294-298.

[10] KYUNG M Y, ROSENFIELD C L, KNIPPLE D C. Ethanol tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae is dependent on cellular oleic acid content[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3): 1499-1503.

[11] 刑建宇, 李春荣, 林挺花, 等. 脂肪酸对酿酒酵母乙醇耐受性的影响[J].食品研究与开发, 2009, 30(6): 33-35.

[12] 蔡定域. 酿酒工业分析手册[M]. 北京:中国轻工业出版社, 1988: 328-330.

[13] AGUDO D C. Lipid content of Saccharomyces cerevisiae strains with different degrees of ethanol tolerance[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, 37(5): 647-651.

[14] MALHOTRA R, SINGH B. Ethanol-induced changes in glycolipids of Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006, 128(3): 205-213.

[15] THAI N D, NAGAHISA K, HIRASAWA T, et al. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size[J]. PLoS ONE, 2008, 3(7): e2623. doi: 10.1371/journal.pone.0002623.

[16] STEELS E L, LEAMONTH R P, WATSON K. Stress tolerance and membrane lipid unsaturation in Saccharomyces cerevisia grown aerobically or anaerobically[J]. Microbiology, 1994, 140(3): 569-576.

[17] 沈楠, 肖冬光, 吴帅, 等. 大豆脂肪酸对酿酒酵母酒精耐性的影响[J].酿酒科技, 2006(11): 17-20.

[18] WERNER-WASHBURNE M, BRAUN E, JOHNSTON G C, et al. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbiological Reviews, 1993, 57(2): 383-401.

[19] COSTA V, AMORIM M A, REIS E, et al. Mitochondrial superoxide disrnutase is essential for ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae in the post-diauxic phase[J]. Microbiology, 1997, 143(5): 1649-1656.

Effects of Fatty Acids on the Ethanol Tolerance of Saccharomyces cerevisiae

WANG Chuan, LUO Huibo, HUANG Dan
(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China)

In the present study, the effects of several fatty acids on the ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae were evaluated by cell survival rate, growth rate and fermentation ability. The results showed that the survival rate of S. ce revisiae under alcohol shock was signifi cantly increased by the addition of two unsaturated fatty acids (palmitoleic acid and oleic acid) in the culture medium, while p almitoleic acid was more effective than oleic acid. The surv ival yeasts also grew fas ter in the medium conta ining alcohol. The two saturated fatty acids palmitic acid and stearic acid made no contribution t o promoting the survival rate and growth rate of S. cerevisiae. On the other hand, w ith the same concentration of unsaturated fatty acids, yeasts cultured to the stationary phase displayed higher survival rate and faster growth rate compared with the exponential phase. However, yeasts cultured with short-chain fatty acids (palmitoleic acid a nd palmitic acid) achieved high alcohol content. The ethanol tolerance results during fermentation were inconsistent with the growth results. Thus the mechanism of ethanol tolerance of S. cerevisiae is different from that of cell growth during fermentation.

Saccharomyces cerevisiae; fatty acids; ethanol tolerance; growth; fermentation

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0190-04

10.7506/spkx1002-6630-20 1519034

2014-10-31

酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放基金项目（NJ2009-11）

王川（1970-），男，副教授，博士，研究方向为微生物及生物产品分离。E-mail：watpc57944@163.com