发酵剂对牦牛乳硬质干酪蛋白降解和苦味关系的影响

刘 瑛，梁 琪,*，宋雪梅，张 炎，黄绍海

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070；2.兰州雪顿生物乳业有限公司，甘肃 兰州 730050）

发酵剂对牦牛乳硬质干酪蛋白降解和苦味关系的影响

刘 瑛1，梁 琪1,*，宋雪梅1，张 炎1，黄绍海2

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070；2.兰州雪顿生物乳业有限公司，甘肃 兰州 730050）

用甘肃天祝新鲜牦牛乳为原料分别添加嗜温、嗜热和混合发酵剂制作硬质干酪，以pH 4.6-可溶性氮（soluble nitrogen，SN）、12%三氯乙酸氮（trichloroacrtic acid-N，TCA-N）、游离氨基酸（free amino acid，FAA）含量和疏水性肽/亲水性肽（S/Q）为蛋白水解度指标，研究3 种牦牛乳硬质干酪在6 个月内成熟过程中苦味和蛋白质降解之间的关系。结果表明：3 种干酪在成熟过程中pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量均呈上升趋势，苦味值与pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量成正相关，相关系数分别为0.400、0.412和0.458。3 种干酪成熟过程中S/Q的变化趋势和程度不同，嗜温发酵剂干酪中S/Q呈现降低趋势；嗜热和混合发酵剂干酪中S/Q均呈现先降低后增大的趋势，但在这两种干酪中S/Q的变化程度不同，嗜热发酵剂干酪在1～3 个月S/Q略有降低，在3～6 个月S/Q快速增大，而混合发酵剂干酪正好相反。S/Q与苦味值成极显著正相关（r=0. 895），S/Q可很好地反映干酪中苦味的强弱。而干酪中苦味强弱与蛋白质降解强弱密切相关，对蛋白降解程度越大的发酵剂制作的干酪越容易产生苦味，其中，嗜热发酵剂对干酪蛋白降解程度最大，混合发酵剂次之，嗜温发酵剂最小。

苦味值；牦牛乳；硬质干酪；蛋白质水解；疏水性肽

在干酪成熟过程中，蛋白质降解一直是人们关注的焦点，它是干酪成熟过程中的重要生化反应[1-2]。蛋白质水解对硬质和半硬质干酪的风味及质地具有重要作用，风味化合物的平衡对干酪的品质影响显著[3-4]，并且还可阻止干酪缺陷风味--苦味的形成，而干酪中苦味主要由蛋白质和肽水解产生的苦味肽累积造成，苦味肽是由凝乳酶和微生物蛋白酶作用于αs1-CN和β-CN的特定序列产生的疏水性肽[5-7]。干酪苦味肽的形成与原料乳的质量以及干酪生产工艺等有关，但是相比之下，凝乳酶和发酵剂对苦味肽的形成影响较大[8]。有研究表明小牛皱胃酶具有高的凝乳活性和低的蛋白质水解活性，特别适用于干酪的生产[9]。因此，选择与小牛皱胃酶匹配的发酵剂是良好品质干酪生产的关键。牦牛乳高的酪蛋白含量虽然可以提高干酪出品率，然而容易使干酪产生苦味，造成风味缺陷。苦味是牦牛乳优质资源进行干酪高端产品开发的主要制约因素，也是国际乳品科学研究的重点，而发酵剂类型对牦牛乳硬质干酪成熟过程中蛋白质水解和苦味形成及变化关系的影响尚无相关文献报道。

本研究以甘肃天祝新鲜牦牛乳为原料，探究不同发酵剂制作的牦牛乳硬质干酪中蛋白质降解程度与苦味形成的关系，以期为牦牛乳干酪苦味的调控和品质研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、菌种与试剂

原料乳为甘肃省天祝县藏族自治区抓喜秀龙乡新鲜牦牛乳。

发酵剂：嗜热发酵剂（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）、嗜温发酵剂（乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种）、混合发酵剂（嗜温和嗜热发酵剂按1∶1组成）均由丹麦丹尼斯克公司生产。

精制小牛皱胃酶（酶活力100 000 U/g） 兰州百灵生物技术有限公司；实验所用试剂除酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸为色谱纯外，其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

pHS-3C酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；DZ-450A型真空包装机 温州市大江真空包装机械有限公司；TGL-20高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；Varian-prostar201超高效液相色谱仪 美国Varian公司；SKD-200凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳硬质干酪加工工艺

干酪加工方法参照高婉伟等[10]的方法。每块干酪质量为26～30 g，经真空包装后的干酪置于10 ℃条件下，分别测定成熟0、1、2、3、4、5、6 个月的各项指标。

1.3.2 干酪苦味感官评定

干酪的苦味值通过感官评定来测定，感官评定小组由经过筛选的18 人组成（男女比例为4∶5，均为不吸烟者），用不同浓度的硫酸奎宁作为参照物，评定员用蒸馏水漱口后，取适量干酪样品置于口中5～10 s后吐出。0 分表示完全无苦味；0～1.0 分表示非常轻微苦味（包括1.0 分）；1.0～2.0 分表示轻微苦味（包括2.0 分）；2.0～3.0 分表示中等苦味（包括3.0 分）；3.0～4.0 分表示强苦味（包括4.0分）；4.0～5.0 分表示非常强苦味（包括5.0 分）。用得分平均值表示干酪的苦味程度[11]。

1.3.3 干酪成熟过程中蛋白质水解度的测定

干酪总氮含量测定依照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；pH 4.6-可溶性氮（soluble nitrogen，SN）含量的测定采用Kuchroo等[12]的方法；12%三氯乙酸氮（trichloroacrtic acid-N，TCA-N）含量的测定采用Agboola等[13]的方法；游离氨基酸（free amino acid，FAA）含量的测定采用茚三酮比色法[14]。

1.3.4 pH 4.6-SN的反相高效液相色谱（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析

参照Dellano等[15]的方法并加以改进。5.0 g干酪和15 mL去离子水在研钵中研磨均匀，40 ℃条件下放置1 h，然后在室温放置15 min。混合物用1 mol/L盐酸调pH值到4.6，4 ℃、4 000×g离心20 min。沉淀回收，用1 mmol/L pH 4.6醋酸铵冲洗一次，4 ℃、3 000×g离心10 min，该过程重复两次，用丙酮冲洗，以除去残留的脂肪。真空冷冻干燥后置于4 ℃条件下备用。RP-HPLC条件：取20 mg的冻干粉溶解于1 mL的去离子水中，上样量25 μL；溶剂A：三氟乙酸-水（0.1∶99.9，V/V）；溶剂B：乙腈溶液-水（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；洗脱条件：0～10 min 15% B，10～80 min 15%～85% B；柱温：40 ℃；检测波长：214 nm。采用外标法，标准物为酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

1.4 数据分析

采用 SPSS17.0软件对数据进行差异显著性分析和Pearson相关性分析，Orign 7.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂对牦牛乳硬质干酪成熟过程中苦味值的影响

成熟干酪有轻微的苦味可对干酪整体风味形成良好影响，但干酪苦味较重会对干酪的风味产生不良影响[5]。由评定人员反映可知，当干酪的苦味值≤2.0时其苦味消费者可以接受，而苦味值超过2.0时消费者会难以接受。牦牛乳硬质干酪成熟过程中苦味值变化见表1。

表1 不同发酵剂对干酪成熟期苦味值的影响Table 1 Effects of different starter cultures on bitterness value during cheese maturation

由表1可知，嗜温发酵剂干酪的苦味值在成熟1～2 个月呈增大趋势，从1.30增加到了2.00，在成熟2～6 个月呈减小趋势，从2.00减小到了0.80，在成熟过程中苦味程度均在可接受的范围内；嗜热发酵剂干酪的苦味值在成熟1～2 个月呈降低趋势，从2.00降低到了1.80，在成熟2～6 个月呈增大趋势，从1.80增加到了3.60；混合发酵剂干酪的苦味值在成熟1～3 个月呈降低趋势，从1.80减小到了0.70，成熟3 个月之后的苦味值在1.50～2.20的范围内变动，除成熟第4个月外，干酪苦味值也一直在可接受范围内。在成熟0～1 个月3 种干酪的苦味值均呈现增大趋势（3 种新鲜干酪均尝不到苦味），但增大程度不同，嗜热发酵剂干酪的增长程度最大，混合发酵剂干酪次之，嗜温发酵剂干酪增长程度最小。总之，嗜温和混合发酵剂干酪的苦味值较低，在成熟第1个月嗜温发酵剂干酪苦味值显著小于混合发酵剂干酪（P＜0.05），成熟第2个月这两种干酪苦味值相差不大，成熟第3个月嗜温发酵剂干酪苦味值显著大于混合发酵剂干酪（P＜0.05），而在成熟4～6 个月嗜温发酵剂干酪的苦味值均显著小于混合发酵剂（P＜0.05）。嗜热发酵剂干酪除成熟2 个月外其余成熟时间苦味值均最大。

2.2 不同发酵剂对牦牛乳硬质干酪成熟期pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量的影响

pH 4.6-SN是衡量蛋白质水解广度的指标，包括由凝乳酶和发酵剂蛋白酶作用于蛋白质产生的中等分子质量肽和小分子质量肽[16]，由表2可知，嗜温发酵剂干酪pH 4.6-SN含量在成熟0～3 个月和5～6 个月增长幅度较大，3～5 个月增长趋于平缓；嗜热发酵剂干酪pH 4.6-SN含量在整个成熟过程中增长幅度都较大，增加了12.96%；混合发酵剂干酪pH 4.6-SN含量在成熟0～2个月和5～6 个月增加幅度较大，2～5个月增长趋于平缓。大量研究证明，12% TCA-N主要是加入的凝乳酶和发酵剂肽酶共同作用产生的更小分子肽和FAA[13]，3 种干酪中12% TCA-N含量在成熟0～2 个月增长幅度缓慢，在2～6 个月增长幅度较大。干酪中FAA由蛋白降解产物多肽的进一步降解而来，是干酪风味物质的前体物质。在成熟0～6 个月的成熟过程中，嗜温发酵剂干酪中FAA含量增加了17.75 mg/g；嗜热发酵剂干酪中FAA含量增加了29.93 mg/g；混合发酵剂干酪中FAA含量增加了26.05 mg/g。在成熟0～2 个月嗜热发酵剂干酪中FAA含量与其他两种干酪中FAA含量差异显著（P＜0.05），3 种干酪中FAA含量均从成熟4 个月开始大量增加，且差异显著（P＜0.05）。氨基酸对干酪苦味也有一定有影响，例如，脯氨酸具有甜味，但当富含脯氨酸的寡肽大量累积时就会产生苦味[17]。

表2 不同发酵剂对干酪成熟期pH 4.6-SN、12% TCCAA--NN和FAA含量的影响Table 2 Effects of different starter cultures on the contents of pH 4.6-SN,, 12% TCA-N, and FAA during cheese maturation

在0～6 个月的成熟过程中，3 种干酪的pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量均呈现增加趋势，混合发酵剂干酪中pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA的含量介于嗜热和嗜温发酵剂之间，嗜热发酵剂干酪中三者含量最高，嗜温发酵剂干酪中三者含量最低。说明嗜热发酵剂对蛋白质降解程度最大，混合发酵剂次之，嗜温发酵剂对蛋白质降解最小。由3 种干酪苦味值变化可知，对蛋白质降解程度越大的发酵剂制作的干酪越容易产生苦味。这与Børsting等[18]认为干酪成熟过程中蛋白质降解程度低，干酪苦味弱相一致。

2.3 不同发酵剂制作干酪中pH 4.6-SN的RP-HPLC分析

干酪的水不溶部分是无味的，干酪中的苦味在接近pH 4.6的水溶部分中是最强烈的[6]，因此，从牦牛乳硬质干酪中提取的pH 4.6-SN用于RP-HPLC分析。3 种干酪成熟1、3、6 个月的RP-HPLC图见图1～3。

图1 嗜温发酵剂干酪中pH 4.6-SN的RP-HPLC图Fig.1 RP-HPLC of pH 4.6-SN in cheese made with mesophilic starter culture

图2 嗜热发酵剂干酪中pH 4.6-SN的RP-HPLC图Fig.2 RP-HPLC of pH 4.6-SN in cheese made with thermophilic starter culture

图3 混合发酵剂干酪中pH 4.6-SN的RP-HPLC图Fig.3 RP-HPLC of pH 4.6-SN in cheese made with mixed starter culture

由图1～3可知，在1～6 个月成熟过程中，不同发酵剂制作的牦牛乳硬质干酪pH 4.6-SN中的亲水性肽和疏水性肽的峰面积有明显差异。根据Dellano等[15]报道可知，在RP-HPLC图中亲水性肽在Phe和Trp之间被洗脱出来，Trp之后的洗脱出来的是疏水性肽，该实验中亲水性肽保留时间是8～29 min，疏水性肽的保留时间是29～80 min，疏水性肽与亲水性肽的峰面积的比值（S/Q）见表3。

表3 不同发酵剂对干酪成熟期S/Q的影响Table 3 Effects of different starter cultures on S/Q ratio during cheese maturation

由于疏水性肽和亲水性肽的峰面积和为100%，因此，S/Q的变化趋势与疏水性肽的变化趋势是一致的。由表3可知，在1～6 个月成熟过程，嗜温发酵剂干酪中S/Q呈降低趋势，降低了1.45%，疏水性肽主要在成熟1～3 个月累积；嗜热发酵剂干酪中S/Q呈先降低后增大的趋势，在成熟1～3 个月S/Q降低了0.18%，在3～6 个月S/Q增加了4.35%，疏水性肽在整个成熟过程中均大量累积，尤其是在6 个月；混合发酵剂干酪中S/Q也呈先降低后增大的趋势，在成熟1～3 个月S/Q降低了2.57%，在3～6 个月S/Q增加了0.32%，疏水性肽主要在成熟1 个月累积。成熟1 个月的3 种干酪中疏水性肽的含量较高，但苦味值并不是特别高，这与成熟初期相对较高的脂肪含量增大了疏水性肽被掩蔽的机会有关，从而使干酪苦味降低[5]。以上研究结果表明，不同发酵剂制作的干酪中疏水性肽的累积时间和程度不同，嗜温发酵剂和混合发酵剂干酪成熟初期疏水性肽含量较高，成熟后期疏水性肽含量低，而嗜热发酵剂干酪正好相反。结合苦味值的变化可知，S/Q较大的干酪苦味值也相对较大，即疏水性肽是干酪苦味的主要影响因素。

2.4 不同发酵剂对牦牛乳硬质干酪蛋白质降解和苦味关系的综合分析

干酪中蛋白质降解产生不同分子质量范围的肽，且这些不同分子质量范围的肽是在残留凝乳酶、发酵剂蛋白酶和发酵剂肽酶共同作用下产生，具体降解过程为：干酪中蛋白在残留凝乳酶（起主要作用）和发酵剂蛋白酶的作用下被降解成大分子肽，大分子肽进一步降解形成小分子肽，随后这些肽类在发酵剂肽酶的作用下进一步降解成更小分子肽、氨基酸、胺、含硫化合物等风味物质[19]。而大量研究表明，干酪中的苦味肽是由分子质量在100～6 000 u的小分子肽组成[20-22]。本实验中3 种干酪所用凝乳酶相同，可以认为各处理间蛋白质降解程度的差异，主要是由发酵剂的不同造成。而不同发酵剂对干酪中蛋白质的降解程度不同，会引起不同分子质量肽的分布不同，若有大量疏水性小分子肽累积，则会使干酪苦味感增强。牦牛乳硬质干酪中蛋白质降解指标和苦味值的相关性分析见表4。

表4 苦味值与S/Q，pH4.6-SN，12% TCA-N和FAA含量的相关性Table 4 Correlation of bitterness value with the contents of pH 4.6-SN, 12% TCA-N and FAA and S/Q ratio

由表4可知，苦味值与pH 4.6-SN含量成正相关，相关系数r=0.400，pH 4.6-SN主要是一些中等分子质量肽和小分子质量肽。苦味值与1 2% TCA-N含量成正相关性，相关系数r=0.412，12% TCA-N主要是小分子质量肽和FA A。说明干酪中苦味的产生与pH 4.6-SN含量和12% TCA-N含量有相关性。苦味值与S/Q成极显著正相关，相关系数r=0.895，说明疏水性肽和亲水性肽的比率可以很好地反映干酪中苦味的强弱。干酪成熟过程中产生的苦味会严重影响干酪品质，这与Kumar等[23]发现，疏水性肽与苦味联系紧密，蛋白质降解程度的增大会使干酪产生不好的风味相一致。在牦牛乳硬质干酪中苦味除了受疏水性肽的影响外，还与苦味氨基酸（Phe、Val等）有关，本实验中，苦味值与FAA含量之间成正相关（r=0.458），说明牦牛乳硬质干酪中FAA含量对苦味有一定的贡献。Ozcan等[24]认为，苦味氨基酸总量不受凝乳酶类型的影响，受发酵剂比例的影响显著，并且随着成熟时间增加含量逐渐升高。

3 结 论

3 种牦牛乳硬质干酪在0～6 个月的发酵成熟过程中，pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量均呈上升趋势，苦味值与pH 4.6-SN、12% TCA-N和FAA含量成正相关，相关系数分别为r=0.400、0.412、0.458。干酪中苦味强弱与蛋白质降解强弱密切相关，对干酪中蛋白质降解程度越大的发酵剂制作的干酪越容易产生苦味，反之，则苦味较弱或没有，例如，在新鲜干酪中蛋白质降解程度极小，因而干酪尝不到苦味。嗜温发酵剂干酪蛋白质降解程度最小，在成熟期该干酪的苦味极弱；嗜热发酵剂干酪中蛋白质的降解程度最大，该干酪的苦味程度也最大，特别是在3～6 个月成熟过程中疏水性肽大量增加，苦味也随之增大；混合发酵剂对干酪蛋白质降解能力适中，该干酪的苦味值也较小。因此，干酪中出现苦味主要是蛋白质降解程度过大，使得疏水性肽大量累积引起，且不同发酵剂制作干酪中疏水性肽大量累积的时间和程度不同，S/Q与苦味值成极显著正相关（r=0.895），其值可以很好地反映干酪中的苦味强弱。

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Effect of Starter Culture on the Relationship between Proteolysis and Bitter Taste of Hard Cheese Made from Yak Milk

LIU Ying1, LIANG Qi1,*, SONG Xuemei1, ZHANG Yan1, HUANG Shaohai2
(1. Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu, College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Xue Dun’s Biological Dairy Industry Co. Ltd., Lanzhou 730050, China)

Hard cheese from yak milk was made with three starter cultures, namely mesophilic starter cu lture, thermophilic starter culture and their 1:1 mixture. In the present study, we explored the relationship between bitter taste and proteolysis of yak milk-derived hard cheeses during the maturation process of 6 months. The contents of pH 4.6-soluble nitrogen (SN), 12% trichloroacrtic acid (TCA)-N and free amino acids (FAAs), and the ratio of hydrophobic peptide to hydrophilic peptide were determined. We found that the contents of pH 4.6-SN, 12% TCA-N and FAAs in the hard cheese, ir respective of the starter culture used, increased d uring the maturation process. Bitterness value had a positive correlation with the contents of pH 4.6-SN, 12%TCA-N and FAAs with correlation coeffi cients of 0.400, 0.412 and 0.458, respectively. The change trend and degree of the ratio between hydrophobic peptide and hydrophilic peptide in the three hard cheeses from different starter cultures were different during the maturation process. The ratio between hydrophobic peptide and hydrophilic peptide tended to decline in the cheese made with mesophilic starter culture, but decreased fi rst and then increased in the cheeses obtained from thermo philic starter culture and mixed starter culture; the degree of change was different in the latter two cheeses. A slight reduction in the ratio between hydrophobic peptide and hydrophilic peptide was observed for cheeses fermented by thermophilic starter culture when the maturation period was extended from 1 month to 3 months, whereas a signifi cantly increased value was achieved by further prolonging the maturation period to 6 months. Nevertheless, the opposite results were found for cheeses fermented by mixed starter culture. Bitterness value had a positive correlation with the ratio between hydrophobic peptide and hydrophilic peptide (r = 0.895). The ratio between hydrophobic peptide and hydrophilic peptide co uld refl ect the intensity of cheese bitter. Bitterness was closely related to proteolysis. Starter culture with a stronger ability todegrade milk protein easyly produced the bitter taste. Thermophilic starter culture had the strongest ability to degrade milk protein, followed by mixed starter culture, and mesophilic starter culture.

bitterness value; yak milk; hard cheese; proteolysis; hydrophobic peptide

TS252.1

A

1002-6630（2015）19-0112-06

10.7506/spkx1002-6630-201519020

2014-12-20

国家自然科学基金地区科学基金项目（31260383）；兰州市科技创新人才团队培育计划项目（2011-1-144）

刘瑛（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：1505872025@qq.com

*通信作者：梁琪（1969-），女，教授，博士，研究方向为食品品质、乳品科学。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn