传统发酵香肠中菌种的分子生物学鉴定

李丙超 胡卫东 唐文才 李兴玲

钟 强 李再新 张 智

（四川理工学院化学与制药工程学院，四川 自贡 643000）

发酵香肠亦称生香肠，是利用自然界有益微生物发酵生产和保存的一种肉食制品。发酵香肠的制作是将切成小块猪、牛和羊等瘦肉和部分肥肉与盐、糖和香辛料等混合，灌入肠衣，经微生物发酵、风干而制成具有特殊发酵香味的肉制品［1，2］，或者采用人工添加微生物发酵剂进行制品发酵，调节微生物发酵群落变化，形成特殊风味。人工添加微生物制剂可以缩短发酵时间，改善香肠的色泽和风味，抑制有害杂菌生长［3］，并延长香肠的保存期［4］。

中国发酵香肠历史悠久，类型众多，主要分为川味香肠和广味香肠。其主要区别为广味甜，川味辣。在发酵过程中，适合在香肠中生长的微生物种类较多，但有益于香肠发酵形成特殊风味口感的微生物并不是很多［5］。为筛选和鉴定香肠发酵的有益微生物，克服传统微生物物种鉴定的不足，本研究拟通过从传统优良发酵香肠中分离、筛选菌株，其后通过真菌ITS以及细菌16SrDNA分子鉴定，构建系统发育树［6］，确定其属种，以期将获得的优良肉制品菌种发酵剂应用于发酵肉和发酵香肠的生产中，进一步提高发酵肉制品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

菌株：从四川简阳某肉制品市场的传统羊肉香肠中采集。

1.1.2 试剂

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、琼脂：分析纯，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

蛋白酶K：30U/mg，德国 Merck公司；

SDS：分析纯，德国Sigma公司；

PCR所用试剂：Taq酶2.5U/μL、dNTPs 2.5mmol/L、10×PCR buffer等，大连宝生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备

电子分析天平：SA5103N型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

生化培养箱：SHP-100型，金坛市晶玻实验仪器厂；

凝胶成像仪：TS2-310型，美国UVP LLC公司；

Eppendorf PCR仪：Mastrcycler nexus gradient型，美国Eppendorf公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离 无菌条件下取25g香肠于225mL无菌生理盐水中，充分振荡，即为10－1样品稀释液，用生理盐水按10倍稀释比稀释至10－6。分别取10－4，10－5，10－6样品稀释液涂布于MRS（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80mL，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO40.25g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.2～6.4，121℃灭菌20min）固体平板，33℃培养48h。根据培养皿上菌落的颜色、表面光滑度、干湿度以及边缘形态将菌落进行初筛。采用反复划线分离单菌落的方法，将初筛的菌株进一步分离，选择没有蔓延且单独的菌落，并镜检分析。

1.2.2 生化试验检测 将分离培养的疑似酵母菌接种于YPD、TTC显色平板，30℃培养24h，观察显色结果。将分离的疑似葡萄球菌和疑似乳酸菌分别接种到灭菌脱脂牛奶（含石蕊25g/L），37℃培养24～36h，另将此两种菌进行过氧化氢触酶试验即将对数生长期的细菌挑取到洁净玻片上，并立即滴加新鲜的3%过氧化氢，立即观察有无气泡。

1.2.3 菌株基因组DNA提取 取2.0mL发酵液于离心管中，12 000×g离心1min，弃上清，收集菌体。采用SDS—酶法［7－10］，其步骤如下：2mL过夜发酵液于12 000×g离心1min，收集菌体，再加入500μL Tris缓冲液（pH 8.0）和300 μL 10%SDS充分混匀后65℃水浴1h，立即置于－80℃放置15min再65℃水浴15min，如此反复冻融3次，再4℃6 000×g离心10min，取上清加入等体积的酚—氯仿—异戊醇（25∶24∶1，V∶V∶V），漩涡震荡5min，室温静置10min后1 3000×g离心20min，取上清加入0.6倍体积异戊醇，室温沉淀1.5h，13 000×g离心20min，去上清，用1mL 70%乙醇洗沉淀一次，室温挥发10min，加入50μL灭菌水并于65℃水浴1h后－20℃保存，作为PCR模板。

1.2.4 菌株16SrDNA和ITS序列分析 以30ng提取的基因组DNA为模板，采用Taq酶和引物（细菌16SrDNA引物：1492R：5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG G-3’，8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；真菌ITS引物序列：ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′，ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）对细菌16SrDNA和真菌ITS进行PCR扩增。细菌的PCR扩增反应体系为：灭菌水33μL；10×PCR buffer 5μL；dNTPs（2.5mmol/L）4 μL；MgCl2（25mmol/L）3μL；1492R（20mmol/L）1μL；8F（20mmol/L）1μL；Taq酶（2.5U/μL）1.5μL；模板（10 ng/μL）3μL；真菌的PCR扩增反应体系为：灭菌水30.5μL；10×PCR buffer 5μL；dNTPs（2.5mmol/L）4μL；MgCl2（25mmol/L）3μL；ITS1（20mmol/L）2μL；ITS4（20 mmol/L）2μL；Taq酶（2.5U/μL）1.5μL；模板（10ng/μL）3μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性50s，94℃变性30 s，55℃退火25s，72℃延伸1min，共25个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收阳性PCR产物，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果输入GenBank数据库，与数据库中收录的16SrDNA和ITS序列比对，得到与分离菌序列相似的菌种16SrDNA和ITS基因序列，用MegAlign软件得到系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离结果

经过MRS培养基分离与镜检，得到3种优势菌，它们的主要形态特征为：A菌菌落较大且表面干燥，突起，边缘圆滑较湿润，呈乳白色，不透明，镜检显示菌体个体形态较大，呈卵球形；B菌菌落较小，表面扁平且较湿润，边缘光滑，呈淡乳白色，不透明，革兰氏染色镜检显示个体形态呈链状或者线状，部分呈“X”形、“Y”形的革兰氏染色阳性菌；C菌菌落较小，表面扁平、平滑、较干燥，呈黄色，不透明，革兰氏染色镜检显示为阳性菌，且个体形态较小，呈典型的球状，无链接状。初步将此3种菌分为：A疑似酵母菌、B疑似乳酸菌、C疑似葡萄球菌。

2.2 生化分析

将疑似酵母菌直接点样接种于YPD平板上培养24h后，再在上层倒入TTC培养基，发现平板上显示红色菌落（图1A），初步判定为酵母菌。石蕊牛奶试验结果显示疑似葡萄球菌和疑似乳酸菌都能使石蕊牛奶变红（图1B和1C），过氧化氢触酶试验显示疑似乳酸菌不产生气泡为阴性，疑似葡萄球菌产生大量气泡为阳性。

图1 疑似菌生化结果Figure 1 The result of biochemical experiment

2.3 PCR扩增16S和ITS序列结果

以分离菌基因组DNA为模板，利用16SrDNA和ITS引物进行PCR扩增，分别得到了约630bp（a泳道）、1 410bp（b泳道）和1 480bp（c泳道）的目的条带（见图2），结果与预期相符。

图2 细菌16SrDNA和真菌ITS序列PCR扩增Figure 2 Electrophoresis of PCR products

2.4 测序及系统进化树的构建

2.4.1 酵母菌ITS序列分析结果 PCR扩增酵母菌ITS序列，测序分析结果表明该序列大小为636bp，将该基因与NCBI数据库进行比对。BLAST比对结果发现该序列与德巴利酵母 ATCCMYA-4749（HQ999977.1）的ITS序列相似度达到99%，利用MegAlign软件构建的系统发育树（见图3），结果表明二者处在同一分支上，进化距离近，最终判断该酵母菌为德氏酵母。

图3 系统发育树Figure 3 System growth trees

2.4.2 葡萄球菌16SrDNA结果 测序结果表明PCR扩增的16SrDNA序列大小为1 411bp，将该序列与NCBI数据库进行比对。BLAST比对结果发现该序列与腐生葡萄球菌YSY1-6株（GU197535.1）的16SrDNA 序列相似度 达到100%，利用MegAlign软件构建的系统发育树（见图4）表明二者处在同一分支上，进化距离近，最终判断为YSY1-6腐生葡萄球菌。

2.4.3 乳酸菌16SrDNA结果 测序结果表明PCR扩增的16SrDNA序列大小为1 489bp，将该序列与NCBI数据库进行比对。BLAST比对结果发现该序列与德式乳杆菌NBRC3376株（AB680073.1）的16SrDNA序列相似度达到99%，利用MegAlign软件构建的系统发育树（见图5）表明二者处在同一分支上，进化距离近，最终判断为德式乳杆菌。

图4 系统发育树Figure 4 System growth trees

图5 系统发育树Figure 5 System growth trees

3 结论

发酵香肠是中国人喜爱的食品，不同工艺和调味料配方，产生不同的风味、香型。其制作过程中的微生物种类及数量变化对香肠品质十分重要［11］。传统微生物技术鉴定香肠中细菌和霉菌的方法主要是依据它们的形态特征和生理特征，但往往只能鉴定到属水平，不能反映与其它物种之间的亲缘关系，而且耗时、工作量大，不利于工业化生产的在线检测［12］。随着分子生物学、基因工程的发展，越来越多的技术被应用于菌种的鉴定，在大大减少工作量的同时显著提高了鉴定的准确性。本研究利用微生物rRNA序列的保守性，从传统羊肉香肠中分离酵母和细菌，以细菌16SrDNA和酵母ITS为指标来鉴定香肠中的微生物，结果发现香肠中德氏酵母、YSY1-6腐生葡萄球菌、德式乳酸乳杆菌亚种较丰富。目前工业上用于发酵香肠的发酵剂主要由乳酸菌、片球菌等混合而成［13］，本研究结论也证明了发酵香肠中的微生物主要组成。根据王永霞［14］的介绍这些细菌降低了香肠的pH且还原了亚硝酸盐，对发酵香肠的质地有明显影响。传统的自然发酵香肠风味往往是乳酸菌、酵母等优势菌与其它杂菌竞争的结果，受季节、地区等外界环境的影响不易大规模生产。通过生理生化与基因鉴定方法，可以得到自然发酵香肠中的优势菌，为模拟自然发酵的风味提供了基础。

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