生物源保鲜剂枯草芽孢杆菌对锦橙贮藏病菌敏感性和保鲜效果

刘浩强，李鸿筠，向可海，冉　春，胡军华，姚廷山，向　琴，杨　华，陈洪明

（1.西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所，重庆400712；2.国家柑橘工程技术研究中心，重庆400712；3.重庆开县南门镇人民政府，重庆405403；4.重庆万州三峡职业技术学院，重庆405403；5.辽宁省果树科学研究所，辽宁营口115009）

生物源保鲜剂枯草芽孢杆菌对锦橙贮藏病菌敏感性和保鲜效果

刘浩强1，2，李鸿筠1，向可海3，冉春1，胡军华1，姚廷山1，向琴4，杨华5，陈洪明1

（1.西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所，重庆400712；2.国家柑橘工程技术研究中心，重庆400712；3.重庆开县南门镇人民政府，重庆405403；4.重庆万州三峡职业技术学院，重庆405403；5.辽宁省果树科学研究所，辽宁营口115009）

研究了生物源保鲜剂枯草芽孢杆菌对锦橙采后主要病菌的毒性及对锦橙果实的贮藏保鲜效果。结果表明：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对青霉菌和绿霉病的毒性较大，EC50值分别为7.4970μg/mL和8.8832μg/mL。保鲜结果表明：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液对青霉病、绿霉病、炭疽病等总病害均有较好的防治效果，比对照药剂250g/L咪鲜胺乳油667倍液效果好。在15～45d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂各处理对锦橙的失重率没有影响；贮藏到60d后，对失重率有一定的影响，枯草芽孢杆菌2000倍液对果实品质的影响和清水对照比较没有差异性，并且对外观色泽和口感没有负面影响。总的来说：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液对锦橙储藏保鲜效果较好。

生物源保鲜剂，敏感性，锦橙，致病菌，保鲜效果

柑橘是世界上最重要的水果之一，全球有多个国家和地区种植柑橘，但主要分布在南北纬度40°区域内具有适宜土壤和气候条件的热带和亚热带地区。在我国南方，柑橘是最广泛种植的水果品种之一。近年柑橘产业发展势头迅猛，产量显著提高，已经成为柑橘主产区农业经济的支柱产业之一[1-3]，为促进农村经济社会发展、有效改善生态环境做出了积极贡献，尤其对我国三峡库区生态建设起到了不可磨灭的作用。但柑橘果实在运输、贮藏过程中容易受到青霉、绿霉和炭疽菌等传染性病害的侵染而造成腐烂损失达10%～30%，严重时高达50%以上[4-7]，通过柑橘采后贮藏保鲜技术来延长果品供应的时间，增加销售期，错开销售高峰，可以更好地减轻集中上市所带来的压力，提高农业经济收益[8-10]。

目前控制柑橘采后病害的主要手段是使用化学保鲜剂，但在我国广大柑橘产区，长期单一使用一种单剂，并且连续多年使用，病菌已经对其产生了抗药性，防治效果大幅下降，并且存在农残问题，对人类健康有潜在危险，现在陆续已被禁止使用，如双胍盐、多菌灵等保鲜剂[11]。为了减轻柑橘在贮藏运输过程中由病害造成的损失，迫切需要研究者们不断寻求一些低毒、高效以及低残留的生物源防腐保鲜新药剂，以取代高毒的、已有抗药性的化学保鲜剂[11-17]。本实验选用1种低毒高效的生物源保鲜剂对柑桔不同贮藏病菌的敏感性以及保鲜效果进行综合评价，进而为其实际应用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

供试锦橙品种锦橙采摘自中国农业科学院锦橙研究所实验果园；供试菌种青霉菌（Penicillium italicumWehmer）、绿霉菌（Penicilliumdigitatum Saccardo）、炭疽杆菌（Colletotrichum gloeosporiorides Penz）、酸腐病（Oospora citriaurantii ex Persoon）；供试混配保鲜剂1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（WP）（2000倍液、3000倍液和4000倍液），德强生物股份有限公司；对照药剂250g/L咪鲜胺乳油Prochloraz667倍液（使用剂量375μg/mL），江苏省扬州市苏灵农药化工有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、氯化钡、葸酮、L-甲硫氨酸、抗坏血酸、邻苯二甲酸氢钾、四氮唑蓝、冰乙酸（均为分析纯） 上海试剂厂。

FA2004电子天平上海方瑞仪器有限公司；UV1800PC分光光度计上海奥析仪器有限公司。PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂；GL-10高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；S212搅拌器上海予华仪器；MLR-351H智能人工气候箱日本三洋公司；DK-S26电热恒温水浴锅上海一科仪器公司。

1.2实验方法

1.2.1室内毒力测定方法采用菌丝生长速率测定法[18-19]。在预实验的基础上，将各药剂分别设置为5个质量浓度梯度，先将保鲜剂分别制成有效成分含量为1、5、10、50、100μg/mL（其中炭疽杆菌酸腐病菌浓度分别为5、10、50、100、200μg/mL）的系列质量浓度马铃薯葡萄糖琼脂培养基[potato dextrose agar（medium），PDA]平面，每个处理的保鲜剂的每个质量浓度均设3次重复。另设加入无菌水的PDA培养基平板作对照。然后用直径6mm的打孔器在病原菌菌落边缘切取生长力一致的菌块，分别移植于各含药PDA培养基平板中央，然后置于（26±0.5）℃恒温培养箱内培养。培养一定时间后，用游标卡尺测量菌落直径（以十字交叉法测量），由菌落直径平均值计算菌丝生长抑制率。用质量浓度对数值（X）与抑制百分率的机率值（Y）进行直线回归分析，检验相关系数的显著性，并求出直线回归方程Y＝a＋bX。根据回归方程求出药剂的半数有效量（median effective concentration，EC50）值及相关系数R。比较1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对几种柑桔贮藏病原菌的毒力大小。

1.2.2贮藏保鲜效果的研究实验在重庆市北碚区中国农业科学院柑桔研究所自然通风贮藏库内进行，实验前进行消毒。实验锦橙转熟期间尚未喷过任何杀菌剂。库房内的温度为自然室温，适当利用开关通风窗的自然换气方法来调节室温。各处理的贮藏条件保持一致。实验期间，贮藏库内的平均温度为15℃，极端最高温度为22℃，极端最低温度为11.0℃，平均相对湿度为81.3%。每处理4次重复（小区），每小区用果100个，每处理共用果400个，使用浸渍法。将不同处理分别完全浸渍于该药液1min捞起晾干，对照用清水浸渍。处理完毕，待药液沥干后将各个小区的果实装进一个塑料果箱，置于通风贮藏库内的铁架上，完全随机排列，2～3d后用聚乙烯薄膜果袋单果套袋，同时记录病果，统计时加以校正。

处理后15d进行第1次调查，以后每15d调查1次，前后共调查4次，即贮藏15、30、45、60d。调查时各处理果实自上而下逐果翻检，将病果取出，然后果蒂朝上放好。每次每小区分别调查记载锦橙青霉病、绿霉病、炭疽病、酸腐病和其他病果数，并将病果取出，然后分别计算病果率和保鲜效果。同时肉眼观察每个处理的果实外观，最后对各处理已编号的果实进行单果称重，并从已编号的果实中选出10个好果的前后单果重来计算失重率。

1.2.3失重的称量处理前每个重复称10kg果，并统计个数，处理前从每个重复中随机取出20个果实进行编号，分别用电子天平称量单果重量。同时肉眼观察每个处理的处理后果实外观，对各处理已编号的果实进行单果称重，并从已编号的果实中选出10个好果的前后单果重来计算失重率（以平均值为准）。

1.2.4枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理后各生理指标变化可溶性固型物：用手持折光仪进行测定；总糖：用葸酮比色法测定[20]；有机酸含量：酸碱滴定法测定[20]；维生素含量：依照GB/T 8210-2011《锦橙鲜果检验方法》中的2，6-二氯酚靛酚法测定[20]。所有实验重复3次，在实验后15、30、45、60d分别抽样测定。

1.2.5数据处理实验数据采用Excel 2000软件进行统计，应用DPS软件进行方差分析[21]。显著性测定采用邓肯氏新复极差（DMRT）法。

2　结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏病菌的敏感性

经DPS数据处理系统分析得到浓度对数值（X）与抑制百分率值（Y）的毒力回归方程、EC50值、相关系数，如表1所示。结果表明，枯草芽孢杆菌WP对青霉菌、绿霉菌、炭疽病菌和酸腐病菌都有一定的抑菌效果，尤其对青霉菌的抑制效果最好，EC50值为7.4970μg/mL，对绿霉菌效果次之，EC50值为8.8832μg/mL，对酸腐病菌的抑制效果最差，EC50值为57.5406μg/mL。

表1　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏病菌的毒力回归分析Table.1　Regression analysis for the toxicity of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP on Penicillium italicum Wehmer

2.2枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏保鲜的整体效果

通过在自然通风贮藏库内用1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏期间病害的防治效果实验研究，结果表明1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000～4000倍液对锦橙防腐保鲜均有一定的效果，见表2。贮藏15d时各处理的防治效果均较好，在63.48%～93.50%之间，此后各处理的防治效果均随着贮藏时间的延长而逐渐下降。贮藏30d时除枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液为62.06%以外，其余各处理防治效果均在70%以上。然而，贮藏45d以后除枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液保鲜效果在70%以上，3000倍液和4000倍液处理均在60%以下。根据方差分析结果表明，贮藏15d时，各个处理间不存在显著性差异；30d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液显著优于其他处理；贮藏到45d和60d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液极显著优于3000倍液和4000倍液；枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液与对照药剂相比较，效果好于对照药剂，综上结果，对锦橙的贮藏保鲜整体效果，以枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液最佳，延长贮藏防腐保鲜的时间最久。

表2　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏保鲜总病害的防治效果（%）Table.2　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against citrus storage total diseases（%）

表3　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙青、绿霉病的防治效果（%）Table.3　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against Peniciuuium and green mold（%）

2.3枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对青霉病、绿霉病的防治效果

结果见表3。通过在贮藏库内用1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏期间进行青霉病、绿霉病防治贮藏实验，结果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏期间发生的青霉病、绿霉病均有较好的防治效果。枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000～4000倍液在15～30d均具有较好的防治效果，效果在68.67%以上，高的可达100%；45d后只枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液表现略差些（为41.67%），其余各处理的防治效果均较为理想，在68.87%～81.14%之间；贮藏到60d后，只有对照药剂250g/L咪鲜胺667倍液防治效果在70%以上，其余各处理效果较差（60%以下），尤其是枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液仅11.73%。但枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液对青霉病、绿霉病均有一定的防治效果，虽然防治效果随着贮藏时间的延长而逐渐下降，但下降程度最慢，结果表明，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙青霉病、绿霉病的各个处理中，防治效果最好的是枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液，防治效果最差的为4000倍液。

2.4枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对炭疽病的防治效果

结果见表4。通过在贮藏库内用1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏期间进行炭疽病防治贮藏实验，结果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对贮藏期间发生的炭疽病具有一定的防治效果。贮藏15d时枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液和3000倍液效果在70%以上，特别是枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液在贮藏15～60d时，效果均在69%以上，总体好于对照药剂250g/L咪鲜胺667×（375μg/mL）。但枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000～4000倍液处理效果相对较差，贮藏30d以后均在50%以下。

表4　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙炭疽病的防治效果（%）Table.4　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against anthracnose（%）

2.5枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对酸腐病的防治效果

结果见表5。通过在贮藏库内用1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙贮藏期间进行酸腐病防治贮藏实验，结果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液，在贮藏15～30d时，效果较好，达70%以上；45d以后，效果在50%以下。然而，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000～4000倍液，在30d以后，防治效果在30%以下，防治效果较差。

表5　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙酸腐病的防治效果（%）Table.5　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against sour disease（%）

2.6枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙失重率的影响

结果见表6。据浸药处理前和贮藏不同时间后各次的调查结果，药后15、30、45d，不同药剂处理后锦橙的失重率各有不同，与清水对照比较，不存在显著性差异；贮藏到60d时，枯草芽孢杆菌3000倍液和4000倍液的失重率在5%的水平上显著高于清水对照。结果表明贮藏15～45d，3种倍数处理对锦橙的失重率没有影响；贮藏到60d后，枯草芽孢杆菌3000倍液和4000倍液对锦橙果实的失重率有一定的影响。

表6　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙失重率的影响（%）Table.6　The effect of the 100 billion/brevibacterium WP on dehydration rate of the Glorious orange（%）

2.7枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙果实外观色泽和口感的影响

药剂处理后贮藏到60d后锦橙果实外观色泽有一定变化，各个处理均由橙黄色逐渐变成橙红色，果实饱满，与清水对照无明显差异。4个处理后果蒂多数保持绿色，清水对照果蒂则已经枯萎。口感结果：枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理的和清水对照比较，风味基本一致，属正常，咪鲜胺略有枯水，风味有所下降。

2.8枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对锦橙果实品质的影响

枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理后对锦橙果实品质的影响，见表7。结果表明：锦橙果实的可溶性固形物在15～30d均略有上升，4个药剂处理与清水对照之间不存在显著性差异，贮藏到60d时下降，只枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液显著低于清水对照。4个药剂处理后总糖、有机酸和维生素C的含量均随着贮藏时间的延长而逐渐下降，下降速度较为缓慢，15～45d时4个处理与清水对照相比，总糖含量无差异显著性，60d时枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液显著低于清水对照；药剂处理后的有机酸均在15～30d时与清水对照无差异，45d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000倍液显著低于清水对照，60d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000～4000倍液处理的显著低于清水对照；药剂处理后的维生素C含量，15～30d时4个处理与清水对照相比，维生素C含量无差异显著性，45d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂4000倍液显著低于清水对照，60d时，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000～4000倍液处理显著低于清水对照，根据以上结果枯草芽孢杆菌2000倍液处理对锦橙的生理指标和清水对照相比，几乎没有影响，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂3000～4000倍液对锦橙果实的品质有一定的影响。

表7　1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂剂处理后对锦橙生理指标的影响Table.7　Physiological indexes influence of the 100 billion/brevibacterium WP of preservatives on Glorious orange

3　讨论

柑橘果实在贮藏运输期间容易发生各种储藏病害[7]。为了减轻贮藏病害所造成的损失，采果后需用保鲜剂处理以防腐保鲜，生产上常用多菌灵、甲基硫菌灵等防治田间病害和贮藏病害，病菌对这些常规杀菌剂已经产生一定程度的抗药性，因此需筛选低毒的化学保鲜剂或者生物源保鲜剂用来防治贮藏病害。生物源保鲜剂作为一种新型保鲜剂现在已广泛应用于柑桔储藏保鲜，生物源保鲜剂枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中可产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌有明显的抑制作用，并且枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉剂酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，与果实体内的消化酶类一同发挥作用，低毒、高效、环境相溶性好，在本实验中取得了较好的实验结果。

保鲜剂对柑橘贮藏病害的保鲜效果不能单一从某一方面来评价，保鲜效果是保鲜剂、果实和环境三者综合作用的结果，应该从贮藏保鲜效果、外观色泽、口感、生理生化营养指标等多方面来评价。水分是影响果实新鲜度、脆度和口感的关键因子，但果实采后水分容易散失。果实在贮藏过程中，随着时间的延长柑橘各个品种的失重率逐渐增加，药剂处理虽不会导致失重率增加，但也不会降低果实的失重率，因此常温贮藏时间不宜过长，以免造成果实失重过多、果皮皱缩，风味变淡而失去商品经济价值。

判断果实营养品质，主要包含可溶性固形物、总糖、有机酸、维生素C等指标[22-25]，贮藏过程中应注意库房通风透气。最好是晴天采果，采果时应注重采果质量，轻拿轻放，采果前剪除手指甲，并戴手套，以免对果皮造成机械伤口，影响贮藏防腐保鲜效果[26]。本研究结果中上述指标与清水对照无差异，表明枯草芽孢杆菌处理对锦橙果实没有负面影响。

4　结论

通过室内保鲜研究，结果表明，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对青霉菌和绿霉病毒性最大，EC50值分别为7.4970μg/mL和8.8832μg/mL；对酸腐烂病的毒性最小，半数有效质量浓度EC50值为57.5406μg/mL。根据保鲜效果来看：1×1011活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液对青霉病、绿霉病、炭疽病等总病害均有较好的保鲜效果，60d对总病害的保鲜效果在70%以上，比对照药剂250g/L咪鲜胺乳油667倍液效果好。枯草芽孢杆菌可湿性粉剂各处理对锦橙的失重率没有影响，只随着贮藏时间的延长，失重率均逐渐增加，贮藏到60d后各处理有一定差异。枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理的和清水对照比较，风味基本一致，枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理对果蒂保持绿色有一定效果，对锦橙果实的内在品质、外观色泽和口感没有负面影响。根据实验结果枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2000倍液可在生产上大量使用。

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Biological preservative of 100 billion/brevibacterium wp on glorious orange storage pathogens sensitivity and preservation effect of fruit storage

LIU Hao-qiang1，2，LI Hong-jun1，XIANG Ke-hai3，RAN Chun1，HU Jun-hua1，YAO Ting-shan1，XIANG Qin4，YANG-Hua5，CHEN Hong-ming1
（1.Citrus Research Institute，Southwestern University/Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China；2.National Citrus Engineering Research Center，Chongqing 400712，China；3.Nanmen Government of Chongqing Kaixian，Chongqing 405403，China；4.Chongqing Three Gorges Vocational College，Chongqing 405403，China；5.Liaoning Provincial Institute of Fruit Tree Science，Yingkou 115009，China）

In this study，the toxicity of the brevibacterium wettable powder（WP）on major postharvest pathogens of citrus and their efficacy in preserving the quality of glorious orange were investigated.The results showed that brevibacterium WP had the stronger toxic effects on Penicillium italicum Wehmer and Penicillium digitatum Saccardo，EC50value were 7.4970μg/mL and 8.8832μg/mL，according to preservation effect of view.The results showed that there were significant control effect of the brevibacterium WP 2000 times against Penicillium，green mold，anthracnose and total diseases，in 60 days.The brevibacterium WP had the better control effect than the control agent prochloraz EC at 667 times，comparison with water control.In 15 to 45 days the 100 billion/ brevibacterium WP dip drug treatment had no effect on the weight loss of Glorious orange.After 60 day the brevibacterium WP had some influence on fruit weight loss Glorious orange.The brevibacterium 2000 times and the water had no difference on fruit nutritional quality impact，but no negative impact on the appearance，color and taste of the Glorious orange fruit.Sum up：the brevibacterium WP 2000 times had better preservation effect of fruit storage to glorious orange.

antimicrobial；sensitivity；glorious orange；pathogens；preservation effect

TS255.3

A

1002-0306（2015）04-0315-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.060

2014－04－14

刘浩强（1978-），男，硕士研究生，助理研究员，主要从事柑橘贮藏病害方面的研究。

国家科技支撑计划课题（2012BAD19B06）；国家星火计划课题（2012GA811001）；公益性行业科研专项（201203034）；重庆市自然科学基金（cstc2011jjA80025）。