响应面法优化脉冲强光对月饼表皮霉菌的杀菌工艺

王　勃，赵　旭，马　涛，*，刘　贺，何余堂，惠丽娟

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州121013；2.辽宁省粮食科学研究所，辽宁沈阳110866）

响应面法优化脉冲强光对月饼表皮霉菌的杀菌工艺

王勃1，赵旭2，马涛1，*，刘贺1，何余堂1，惠丽娟1

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州121013；2.辽宁省粮食科学研究所，辽宁沈阳110866）

采用响应面法分析优化脉冲强光对月饼表面杀菌的工艺参数。在单因素实验基础上，选取闪照次数、闪照距离、闪照能量为因素，霉菌杀菌率为指标，通过响应面优化模型确定脉冲强光杀菌的最佳条件为：闪照次数为34次、闪照距离为10cm、闪照能量为400J，此条件下脉冲强光对月饼表面霉菌杀菌率可达到99.85%。采用上述分析的最佳杀菌条件处理的月饼，在国标规定的霉菌数量范围内，其货架期比空白样品延长了30d，并且其酸价和过氧化值都符合国标规定，说明脉冲强光对月饼油脂稳定性没有显著影响，不会影响月饼品质。

脉冲强光，月饼，霉菌，杀菌率，货架期

月饼含有丰富的油脂和糖分，受热受潮都易发霉、变质。中秋节前夕，月饼的市场需求量集中加大，月饼厂商需赶制大批量月饼。以上种种因素使得月饼需要提前一个月甚至更久就生产出来，这其中的制作过程如果杀菌不彻底及包装贮藏不当，都会造成微生物的超标，尤其是烘烤熟制的月饼在冷却、包装过程中更容易受到环境、人为等的二次污染，影响月饼的食用安全，缩短货架期。

脉冲强光杀菌技术是近些年来出现的一种非热杀菌新技术，它利用瞬时、高强度的脉冲能量杀灭食品和包装上各类微生物，有效的保持食品质量，延长食品货架期[1]。该技术由于只处理食品的表面，从而对食品的风味和营养成分影响很小，可用于延长以透明物料包装的食品及新鲜食品的货架期[2]。脉冲强光主要涉及粮油制品、果蔬制品、水产制品等食品杀菌保藏方面[3-7]，在焙烤制品上的应用国内外鲜有报道。本文研究了脉冲强光对月饼表皮霉菌杀菌的效果，为延长月饼货架期应用脉冲强光杀菌技术提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

月饼实验室自制；月饼皮配料为53%的面粉，15%豆油，31%糖浆，1%枧水；月饼馅购自青岛汇丰苑食品公司；冰乙酸、碘化钾、酚酞天津市北辰方正试剂有限公司；可溶性淀粉天津市风船化学试剂有限公司；孟加拉红培养基北京奥博星生物技术有限责任公司；硫代硫酸钠标准滴定溶液[c（Na2S2O3）＝1.000mol/L]、氢氧化钾标准滴定溶液[c（KOH）＝1.000mol/L] 上海晶纯生化科技股份有限公司；三氯甲烷、乙醚锦州古城化学试剂厂；石油醚、乙醇天津市天力化学试剂有限公司。

AR224CN电子天平豪斯仪器（上海）有限公司制造；BPS-100CA恒温恒湿培养箱、DHG-9055A电热鼓风干燥箱、LRH-150生化培养箱、数显恒温水浴锅上海一恒仪器科学有限公司；EC2菌落计数仪法国梅里埃生物公司；GMSX-280压力蒸汽灭菌器北京市永光明医疗仪器有限公司；MiniMix 400W拍打均质器法国Interscience公司；SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气净化有限公司；TDZ4-WS台式低速自动平衡离心机长沙湘智离心机仪器有限公司；ZWB-I-01（LA50-800H）脉冲强光杀菌器宁波中物光电杀菌技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1月饼制作工艺

豆油、糖浆、枧水

↓机械搅拌

月饼粉配制→混合→醒发→包馅→压模→烘烤→冷却→包装→成品月饼

1.2.2样品的处理实验室自制月饼重量为100.0g，其中月饼皮45.0g，月饼馅55.0g。焙烤好的月饼在焙烤完成之后要迅速移至无菌室内，待月饼表皮温度降至常温后再进行包装，这样的操作使月饼在包装环节中尽可能减少被杂菌污染的概率，确保实验结果的客观准确性[8]。无菌操作条件下，从包装袋中取出月饼放置于无菌的石英板上，通过调整石英板的高低来实现样品与脉冲氙灯之间的距离，根据单因素实验结果更改操作界面上的脉冲次数和脉冲能量，闪照频次为2次/s。闪照后将月饼皮馅分离，取远离月饼馅的饼皮25.0g，放入盛有225mL无菌水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1∶10的样品匀液，摇匀液进行活菌平板计数。取同等质量的月饼饼皮不做任何处理，培养5d后得到的活菌数即为月饼饼皮样本的原始菌落数。

1.2.3霉菌的检测参照国标GB 4789.15-2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数[9]。

脉冲强光的杀菌效果依据微生物的杀菌率来评价，杀菌率的计算公式如下：

式中：A0：原始菌落数，A：处理后的菌落数。

1.2.4单因素实验固定闪照距离为10cm，闪照能量为300J，研究闪照次数为20、25、30、35、40次对月饼杀菌效果的影响；固定闪照次数为30次，闪照能量为300J，研究闪照距离为9、10、11、12、13cm对月饼杀菌效果的影响；固定闪照次数30次，闪照距离10cm，研究闪照能量100、200、300、400、500J对月饼杀菌效果的影响。

1.2.5响应面法优化脉冲强光对月饼表面杀菌效果的影响以霉菌的杀菌率为响应值进行响应面实验设计，优化脉冲强光杀菌工艺条件[10-12]。根据Box-Behnken的中心组合设计原理[13]，通过Design Expert 8.0.6软件对实验数据进行分析，预测脉冲强光杀菌的最佳工艺条件。各因素及水平编码如表1所示。

表1　响应面优化实验因素水平表Table.1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

1.2.6月饼货架期的微生物指标测定无菌操作条件下，选取50个外观良好的月饼对其进行脉冲强光处理，设定杀菌参数为上述响应面分析出的最佳杀菌条件。再选取另50个月饼不做任何处理，一同放入25℃的恒温培养箱中，每天选取一个经过脉冲强光处理的月饼和一个未做处理的月饼作为对照，直到样品霉菌数超过国标规定值，无需再测定。霉菌数的检测方法按照参照国标GB 4789.15-2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数。每种样品做3次平行实验。

1.2.7月饼货架期的理化指标测定

1.2.7.1酸价的测定称取20.0g月饼饼皮于研钵中磨碎，置于锥形瓶中，石油醚浸泡过夜后离心取上清液倒入三角瓶中，45℃水浴挥去石油醚，放置干燥箱中1min烘干瓶身水分，得到所需油脂[14]。

称取3.0g混匀的油脂样品，置于锥形瓶中，加入50mL中性乙醚-乙醇（2＋1）混合液，放置于恒温振荡器（参数设定为：40℃，5min）使油脂溶解。取出后冷却至室温，加入酚酞指示液2～3滴，以氢氧化钾标准滴定溶液（1.000mol/L）滴定，至出现微红色且半分钟内不褪色为指示终点。每次测定做3次平行实验。

酸价的测定原理以及计算公式均参照国标GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法[15]。

1.2.7.2过氧化值的测定油脂样品的提取参照上述酸价测定的方法进行，过氧化值的测定原理以及计算公式均参照国标GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1闪照次数对杀菌率的影响由图1可以看出，在闪照次数为25～35次时，杀菌率提升的较为明显，在35～40次时，杀菌率提高趋缓。随着脉冲强光照射次数的增加，平板上的菌落数逐渐减少[16]。当闪照次数为35次时，其杀菌率为99.55%，所残留的微生物菌落数符合国标规定。鉴于节约杀菌成本并综合考虑两评价指标的最佳闪照次数，选取25、30、35次继续对月饼的杀菌效果做响应面分析以确定最佳的闪照次数。

图1　闪照次数对杀菌效果的影响Fig.1　Effect of flash time on sterilization rate

2.1.2闪照距离对杀菌率的影响由图2可以看出，随着闪照距离的增大，杀菌率呈减少趋势。这是因为随着脉冲强光与月饼的距离越远，脉冲强光的能量越弱，杀菌效果也越差。综合考虑两评价指标的最佳闪照距离，选取9、10、11cm继续对月饼的杀菌效果做响应面分析以确定最佳的闪照距离。

图2　闪照距离对杀菌效果的影响Fig.2　Effect of flash distance on sterilization rate

2.1.3闪照能量对杀菌率的影响由图3可以看出，随着闪照能量的增加，杀菌率呈增加趋势。在闪照能量为100～300J时，杀菌率明显提高，而在400～500J时，杀菌效果提升的并不明显。脉冲强光处理对细胞膜造成了严重损伤并大幅降低了胞内酶的活性，这也可能是霉菌致死的主要原因之一[17]。综合考虑两评价指标的最佳闪照能量，选取200、300、400J继续对月饼的杀菌效果做响应面分析以确定最佳的闪照能量。

图3　闪照能量对杀菌效果的影响Fig.3　Effect of flash energy on sterilization rate

2.2实验模型的建立及显著性检验

应用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken中心组合实验设计，以闪照次数、闪照距离、闪照能量为因素，以微生物杀菌率为响应值（Y），进行三因素三水平共17个实验点（包括5个零点）的响应面实验设计组合，实验设计及结果如表2所示。

表2　Box-Behnken实验设计及结果Table.2　Box-Behnken experimental design arrangement and corresponding results

根据表2的实验结果，将实验数据进行逐步回归拟合，得到以杀菌率（Y）为目标函数的二次回归方程模型为：

Y＝96.95＋3.75X1－0.91X2＋2.56X3＋0.59X1X2－ 1.24X1X3－0.58X2X3－0.81X12－0.33X22－1.51X32

对该数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数。回归模型进行方差分析及可信度分析结果见表3。

根据α=0.05显著水平剔除不显著项，简化后的回归方程为：

Y＝96.95＋3.75X1－0.91X2＋2.56X3＋0.59X1X2－ 1.24X1X3－0.58X2X3－0.81X12－1.51X32

根据表3可知，模型p＜0.0001，表示模型是极显著的，证明模型成立，本实验方法是可靠的。失拟项不显著（p=0.8609＞0.05），表明回归方程无失拟因素存在，回归方程拟合较好。进一步解释验证在实验范围内可以用来解释和预测实验结果。一次项系数X1、X2、X3的系数都是极显著（p＜0.0001），说明闪照次数、闪照距离及闪照能量对脉冲强光的杀菌率影响有显著作用。交互项X1X2（p=0.0069＜0.01），交互项X2X3（p=0.0075＜0.01），交互项X1X3（p＜0.0001）的交互作用对杀菌率的影响极显著。综上所述，影响因素的主次顺序为：X1（闪照次数）＞X3（闪照能量）＞X2（闪照距离）。模型的校正决定系数（Adj R-Square）为0.9920，说明该模型能解释99.20%的响应值的变化，该方程与实际拟合的较好，能有效反应脉冲强光杀菌率与闪照次数、闪照距离和闪照能量之间的关系，因此所得的方程能预测响应值随各参数的变化规律[18-19]。

表3　响应面方差分析Table.3　Analysis of variance for the fitted mathematical model

2.3响应面因素水平的优化及验证

将任一个因素固定在建立好的回归模型的零水平上，其余交互的两因素的结果也将由此得出，二次回归方程的3D响应面图见图4～图6。下图可反映出脉冲强光杀菌率在各因素的中心点附近可获得最大值。

根据编码公式求出自变量X1、X2、X3的编码值为X1=0.915，X2=－0.127，X3=0.712，对应的真实值为：X1= 33.77，X2=9.82，X3=377.45，即闪照次数为33.77次，闪照距离为9.82cm，闪照能量为377.45J，此时预测的杀菌率可达到99.8221%。

图4　闪照次数、闪照距离及其交互作用的3D响应面Fig.4　3D response surface plot showing the effects of flash time，flash distance and their mutual interactions

图5　闪照次数、闪照能量及其交互作用的3D响应面Fig.5　3D response surface plot showing the effects of flash time，flash energy and their mutual interactions

图6　闪照距离、闪照能量及其交互作用的3D响应面Fig.6　3D response surface plot showing the effects of flash distance，flash energy and their mutual interactions

为检验响应面的可靠性，在最佳杀菌条件下进行验证实验，考率到实际操作，将最佳条件修正为：闪照次数为34次、闪照距离为10cm、闪照能量为400J，此条件下进行3次平行实验，脉冲强光杀菌率为99.85%，与预测值相接近，说明回归方程能够较为直观地反映和模拟各因素对脉冲强光杀菌率的影响，结果表明该模型是合理有效的，在实际情况中具有一定的指导意义。

2.4货架期的理化及微生物指标测定结果

根据《GB 7099-2003糕点、面包卫生标准》进行评价，热加工糕点和面包的霉菌指标是≤100cfu/g，冷加工是≤150cfu/g[20]。酸价（以脂肪计）≤5mg KOH/g，过氧化值（以脂肪计）≤0.25g/100g。

表4　脉冲强光杀菌对月饼微生物和理化指标的影响Table.4　Effect of intense pulsed light does on the microorganism and physicochemical indexes of moon cake

由表4可知，未做处理的月饼在第20d的时候，霉菌数量已经超过国标规定的100cfu/g，而经过脉冲强光杀菌后的月饼在第50d的时候，霉菌数量才超过国标规定，比未做处理的月饼货架期延长了30d。这说明月饼经过脉冲强光杀菌能够延长其货架期，并且微生物霉菌数量在货架期延长期内都符合国标要求。理化指标的测定结果表明，经过脉冲强光杀菌后的月饼在50d内的酸价和过氧化值均符合国标规定。以上结果表明，脉冲强光杀菌能够在符合国标规定的情况下有效地延长月饼的货架期。

3　结论

采用脉冲强光杀菌技术可以有效杀灭月饼表面污染的霉菌，在单因素实验基础上，利用响应面法对脉冲强光在月饼的杀菌条件进行优化，建立了闪照次数、闪照距离、闪照能量3个因素对杀菌率的二次回归方程模型。最佳条件为：闪照次数为34次、闪照距离为10cm、闪照能量为400J，此条件下脉冲强光对月饼表面霉菌杀菌率可达到99.85%。

采用响应面法分析出的脉冲强光杀菌最佳条件，在国标规定的霉菌数量范围内，经过脉冲强光处理的月饼比未作处理的月饼货架期延长了30d，并且其酸价和过氧化值都符合国标规定，证明脉冲强光处理在货架期内对月饼油脂稳定性没有显著影响，不会影响月饼品质。

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Sterilizing effect of pulsed light on the mould which is on the moon cake surface

WANG Bo1，ZHAO Xu2，MA Tao1，*，LIU He1，HE Yu-tang1，HUI Li-juan1
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China；2.Grain Science Research Institute of Liaoning Province，Shenyang 110866，China）

The pulsed light sterilizing parameters for moon cake surface were optimized by RSM.The impacts of flash times，flash distance and flash energy，sterilization rate were investigated.Results showed that optimal sterilizing conditions were flash times of 34，flash distance of 10cm，flash energy of 400J.Under the optimized conditions，bacteria sterilization rate could reach to be 99.85%.The best sterilizing conditions were optimized by using RSM.In the number range of mold in National Standard，it could be extended 30 days than blank sample.The acid value and the peroxide value were in accordance with the National Standard.The pulsed light had no significant effect on the oil stability and quality of mooncake.

pulsed light；moon cake；moulds；sterilization rate；shelf life

TS201.3

B

1002-0306（2015）04-0255-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.047

2014－05－26

王勃（1986-），男，硕士，实验员，研究方向：粮油科学。

马涛（1962-），男，博士，教授，研究方向：粮油科学。