莲藕多酚的提取工艺优化及抗氧化活性评价

覃海明，艾有伟，易　阳

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023）

莲藕多酚的提取工艺优化及抗氧化活性评价

覃海明，艾有伟，易阳*

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023）

通过单因素实验确定了乙醇浓度、料液比、pH、温度和时间对莲藕多酚浸提得率的影响，并建立了乙醇浓度、料液比、pH和时间的四因素回归模型。基于响应面分析和实际应用考虑，确定莲藕多酚的超声波提取工艺条件为：乙醇浓度40%、料液比1∶22、pH3、时间72min，浸提得率预测值为0.22%，实际值为0.23%。在该条件下，莲藕多酚粗提物得率为1.12g/100g鲜重，其中多酚含量为19.73mg GAE/100mg干重。莲藕多酚粗提物的DPPH自由基清除IC50值为351.56μg/mL，ABTS自由基清除IC50值为308.80μg/mL，FRAP抗氧化能力为0.21mg TE/mg粗提物，作为天然抗氧化剂应用前景良好。

莲藕，多酚，提取，抗氧化

莲藕为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera G.）的肥大根茎，是我国种植面积最大且产量最高的水生蔬菜，主要分布在湖北、湖南和浙江等省[1]。莲藕极为常见，但其清热、止血、调节内分泌、滋补安神等生理功效却引人关注，且在多种古医书和药典中均有记载。基于β-胡萝卜素/亚油酸乳化液法、FRAP法和DPPH法的化学抗氧化评价体系证实，莲藕在常见的数十种蔬菜中表现出较强的抗氧化活性[2-4]，而其抗氧化能力与酚类物质含量成正比[5]。此外，莲藕多酚及其提取物还能抑制金黄色葡萄球菌[6]、降血糖[7]、增强记忆力及神经发育[8-9]。不同品种莲藕的平均总酚含量约为117mg/100g鲜重[4]，主要由多巴、儿茶酚、没食子酸、D-（+）-儿茶素和L-（-）-表儿茶素等组成[10]。作为莲藕的主要功能活性成分，多酚的制备开发对促进产业精深加工并延展产业链具有重要意义。

目前，关于莲藕多酚的提取工艺仍限于单纯的溶剂浸提，多酚的相对得率不高[6，11]。超声波辅助在植物多酚类物质的提取研究中应用广泛，产生的热作用、机械作用和空化效应不仅能有效促进游离态多酚的溶出[12]，还可能释放与细胞壁通过酯键结合的结合态多酚，显著提高多酚提取率。本实验采取响应面优化莲藕多酚的超声波辅助浸提工艺，并通过体外化学体系评价提取物的抗氧化活性，旨为莲藕多酚的开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜九孔莲藕由武汉世林福幸科技发展有限公司蔡甸莲藕基地提供，洗净后整藕切块粉碎，混匀后置于-20℃贮存备用；没食子酸（Gallic acid）、水溶性维生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ） 东京化成工业株式会社；福林酚试剂、醋酸钠、过硫酸钾、三氯化铁、乙醇、乙酸等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

SB-5200DNT超声波清洗仪宁波新芝生物科技股份有限公司；PHS-25型pH计上海虹益仪器仪表有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计日本岛津有限公司；电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2莲藕多酚的提取

1.2.1莲藕多酚的提取测定取粉碎莲藕渣3.0g，加入一定料液比的乙醇溶液，置于控温的200W超声场中持续浸提。浸提完成后，过滤分离滤液，并定容至100mL，混匀后测定多酚浓度。

1.2.2莲藕粗多酚的制备将优化的工艺参数放大30倍提取莲藕多酚，浸提液过滤浓缩后，经真空冷冻干燥得到粉末状的浅黄色多酚粗提物。

1.3多酚含量测定与计算

多酚含量参考文献[13]，多酚含量以没食子酸当量（GAE）表示。多酚浸提得率（%）以浸提液中多酚GAE占原料湿重的百分比表示。粗提物中多酚含量（mg GAE/100mg DW）以多酚GAE与样品的质量比表示。

1.4莲藕多酚提取的单因素实验

1.4.1乙醇浓度（乙醇体积比浓度）的确定乙醇浓度0、20%、40%、60%、80%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，温度40℃，时间20min。

1.4.2料液比的确定乙醇浓度40%，料液比（g/mL）1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，pH4，温度40℃，时间20min。

1.4.3pH的确定乙醇浓度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH2、3、4、5、6，温度40℃，时间20min。

1.4.4温度的确定乙醇浓度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，温度20、30、40、50、60℃，时间20min。

1.4.5时间的确定乙醇浓度40%，料液比（g/mL）1∶15，pH4，温度40℃，时间5、10、20、40、60min。

1.5莲藕多酚提取的响应面实验

在单因素实验的基础上，采用Box-Benhnken的中心组合设计安排四因素三水平实验，优化确定莲藕多酚的最佳提取工艺条件，实验因素及水平见表1。

1.6莲藕多酚粗提物的抗氧化活性评价

1.6.1DPPH自由基清除能力莲藕多酚粗提物经40%乙醇溶解并稀释成合适浓度梯度。取50μL样液加入0.7mL DPPH溶液（100μmol/L）中混匀作为实验组，以50μL的40%乙醇混合0.7mL DPPH溶液作为空白对照。避光保存30min后，于517nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率（%）=（1-A实验组/A空白对照）×100[14]。

1.6.2ABTS自由基清除能力莲藕多酚粗提物的ABTS自由基清除能力参考文献[13]的方法测定。取50μL样液加入1mL ABTS溶液中混匀作为实验组，以40%乙醇作为空白。室温下避光静置30min后于波长734nm下测其吸光值。ABTS自由基清除率（%）=（1-A实验组/A工作液）×100。

表1　实验因素和水平Table.1　Factors and levels of the experiment

1.6.3FRAP抗氧化能力莲藕多酚粗提物的FRAP抗氧化能力参考文献[13]的方法测定。粗多酚的FRAP抗氧化能力以每毫克粗提物对应的Trolox当量表示（mg Trolox equivalents/mg，mg TE/mg）。

1.7数据处理

多因素实验设计和响应面数据分析采用SAS（V8）软件处理。组间数据差异比较采用SPSS11.5软件S-N-K检验分析，显著性水平为p＜0.05。图中不同小写英文字母表征0.05水平的显著性差异。实验及检测均平行重复三次。

2　结果与分析

2.1莲藕多酚提取的单因素实验结果

2.1.1多酚测定标准曲线绘制以没食子酸为标准品测定多酚含量，建立标准曲线的回归方程为：y= 0.016x+0.062（R2=0.998），其中y为吸光值，x为没食子酸浓度（μg/mL）。

2.1.2乙醇浓度对多酚浸提得率的影响多酚是一类极性范围相对较宽的化合物，而浸提溶剂极性与多酚极性相当时，有利于多酚的提取。不同浓度乙醇溶液的极性大小存在差异，对莲藕多酚浸提得率的影响如图1所示。多酚浸提得率随乙醇浓度增加先增大后减小，乙醇浓度介于20%～60%间的浸提得率（0.16%～0.18%）无显著差异（p＞0.05），但均显著高于纯水和80%乙醇溶液（p＜0.05）。莲藕多酚提取相关研究文献选择的乙醇浓度范围为40%～60%[6，11，15]，与本研究结果较为吻合。故莲藕多酚浸提的乙醇浓度选定为20%～60%。

2.1.3料液比对多酚浸提得率的影响由图2可见，料液比1∶5时的多酚浸提得率仅为0.15%，显著低于其他实验组（p＜0.05）。料液比1∶10和1∶15时的多酚浸提得率无明显差异（p＞0.05），但均显著低于料液比1∶20（p＜0.05）。随着料液比的进一步减小，多酚浸提得率并未出现显著增加（p＞0.05）。故莲藕多酚浸提的料液比范围选定为1∶15～1∶25。

2.1.4pH对多酚浸提得率的影响pH对莲藕多酚浸提得率的影响如图3所示，随着pH的增加，多酚浸提得率先增大后减小。但pH介于2～5之间的多酚浸提得率变化并不显著（p＞0.05），而pH3时的得率显著高于pH6（p＜0.05）。植物组织内多酚一部分以游离形式存在于液泡中，一部分与蛋白质和多糖通过氢键或疏水键结合存在于细胞壁中[12]，而酸性条件有利于结合酚的释放。故莲藕多酚浸提的pH范围选定为2～3。

图1　乙醇浓度对莲藕多酚浸提得率的影响Fig.1　Effect of ethanol volume percent on the extraction yield of polyphenol from lotus root

图2　料液比对莲藕多酚浸提得率的影响Fig.2　Effect of material-to-solvent ratio on the extraction yield of polyphenol from lotus root

图3　pH对莲藕多酚浸提得率的影响Fig.3　Effect of pH on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.1.5温度对莲藕多酚浸提得率的影响一般而言，温度越高越利于植物材料中多酚的溶出和扩散，并增加其溶解度，能有效提高多酚的浸提得率。但在莲藕多酚浸提过程中，超声波的辅助作用可能屏蔽了温度的影响，以致温度在20～60℃范围内对莲藕多酚浸提得率无显著影响（p＞0.05），如图4所示。故莲藕多酚浸提在室温下进行即可。

图4　温度对莲藕多酚浸提得率的影响Fig.4　Effect of temperature on the extraction yield ofpolyphenol from lotus root

2.1.6时间对莲藕多酚浸提得率的影响由图5可见，莲藕多酚浸提得率随浸提时间延长显著增加（p＜0.05）。超声波浸提时间越长，对物料的作用越充分，多酚溶出量持续增加。但超声波处理20min后，多酚浸提得率随时间延长而增加的幅度减小。此外，超声波处理时间过长，可能导致多酚结构破坏[16]，且能耗较高。故莲藕多酚浸提的时间选定为20～60min。

图5　时间对莲藕多酚浸提得率的影响Fig.5　Effect of time on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.2莲藕多酚提取的响应面实验结果

2.2.1回归模型检验响应面实验安排及结果如表2所示。以乙醇浓度X1、料液比X2、pH X3、浸提时间X4为实验因素，建立以莲藕多酚浸提得率Y为考察指标的回归模型：Y=0.2100+0.0026X1+0.0096X2-0.0021X3+ 0.0138X4-0.0159X12-0.0018X1X2-0.0014X1X3-0.0015X1X4-0.0154X22+0.0067X2X3+0.0011X2X4-0.0124X32+0.0004X3X4-0.0044X42。

方差分析结果表明（表3），考察指标Y的决定系数R2值为96.32%，回归达到极显著水平（p＜0.0001）。逐项显著性检验结果显示，线性项和交互项对Y无显著影响（p＞0.05），而平方项对其有极显著影响（p＜0.0001）。各因素对莲藕多酚浸提得率的影响程度依次为浸提时间＞料液比＞乙醇浓度＞pH，其中仅时间和料液比的影响显著（p＜0.01）。

表2　实验设计及结果Table.2　Experimental design and results

2.2.2双因素交互作用分析由表3可知，仅交互项X2X3对Y有显著影响（p＜0.01），其交互作用如图6所示。将乙醇浓度和浸提时间固定在零水平：浸提得率随pH或料液比的增大先增加后减小；随着料液比的增加，浸提得率极值点由pH-0.30水平向0.15水平偏移；随着pH的增加，极值点由料液比0.15水平向0.50水平偏移。

图6　料液比和pH对莲藕多酚浸提得率的交互影响Fig.6　Interaction of material-to-solvent ratio and pH on the extraction yield of polyphenol from lotus root

2.2.3最佳工艺条件优化采用RSREG Procedure分析回归模型得到一个极值点（Y=0.2229），该点各因子的编码值为：X1=-0.0278、X2=0.3832、X3=0.0476、X4=1.6111，即最佳条件为乙醇浓度39.44%、料液比1∶21.92、pH 3.05、时间72.22min。时间编码值超出实验因素水平范围，但与其他因素不存在交互作用，且浸提得率随时间增加而增大，可能在72.22min后趋于稳定或降低，与时间单因素结果吻合。考虑实际应用调整工艺条件为乙醇浓度40%、料液比1∶22、pH3、时间72min，在此条件下的浸提得率预测值为0.22%，实际值为0.23%。换算成多酚粗提物得率为1.12g/100g鲜重，多酚含量为19.73mg GAE/100mg干重多酚粗提物。

表3　回归模型方差分析Table.3　Analysis of variance with regression model

2.3莲藕多酚粗提物的抗氧化活性

由图7可见，Trolox和莲藕多酚粗提物的自由基清除能力呈现明显的剂量依赖性，两者对DPPH自由基清除的IC50值分别为68.59μg/mL（y=0.724x+0.338，R2=0.998）和351.56μg/mL（y=0.132x+3.593，R2=0.996），而对ABTS自由基清除的IC50值分别为64.33μg/mL（y= 0.773x+0.273，R2=0.998）和308.80μg/mL（y=0.174x-3.731，R2=0.994）。在自由基半数清除条件下，1mg莲藕多酚粗提物仅相当于约0.20mg Trolox。此外，通过Trolox的FRAP抗氧化能力标准曲线（回归方程为y= 0.0059x+0.0019，R2=0.997，其中y为吸光值，x为Trolox浓度），测定莲藕多酚粗提物的FRAP抗氧化能力为0.21mg TE/mg（表4）。以40%乙醇作为溶剂提取莲藕多酚的同时，具有抗氧化活性的低分子量多糖或多糖蛋白复合物可能随之溶出[4]，但其抗氧化能力相比多酚类物质较弱。严守雷分离得到莲藕多酚组分I和组分II的纯度分别为40.93%和14.12%，两者对羟基自由基的清除IC50值分别为0.387%和2.572%[6]，说明多酚粗提物抗氧化活性可能与其多酚含量有密切关联，借此推测高纯度莲藕多酚提取物的抗氧化活性可能与Trolox相当。油脂中加入莲藕多酚能显著降低其氧化水平，延长贮藏期[6，11]。另外，莲藕多酚还能抑制H2O2诱导的小鼠红细胞氧化溶血，减少小鼠肝匀浆MDA生成及肝线粒体肿胀[15]。由此可见，莲藕多酚粗提物在化学及生物体系中均表现出有效的抗氧化功能，用于食品品质维持和功能食品开发前景广阔。

图7　莲藕多酚粗提物的自由基清除能力Fig.7　The free radical scavenging ability of crude polyphenol extract from lotus root

表4　莲藕多酚粗提物的抗氧化活性Table.4　The antioxidant activities of crude polyphenol extract from lotus root

3　结论

结合单因素实验和响应面实验，以浸提得率为指标优化莲藕多酚的超声波提取工艺条件为：乙醇浓度40%、料液比1∶22、pH3、时间72min。在该条件下的莲藕多酚实际浸提得率为0.23%，与预测值的差异小于5%，而莲藕多酚粗提物得率为1.12g/100g鲜重。该粗提物中多酚含量为19.73mg GAE/100mg干重，其DPPH自由基清除IC50值为351.56μg/mL，ABTS自由基清除IC50值为308.80μg/mL，FRAP抗氧化能力为0.21 mg TE/mg粗提物。莲藕多酚作为天然抗氧化剂具有广阔的开发和应用前景，但本研究中粗提物的多酚含量较低，其抗氧化活性偏弱，需进一步分离纯化提高纯度，且单体酚组成有待解析。

[1]熊桂云，童军，刘冬碧，等.湖北省莲藕生产与施肥现状调查[J].湖北农业科学，2011，50（19）：3934-3939.

[2]Kaur C，Kapoor H C.Anti-oxidant activity and total phenolic content of some Asian vegetables[J].International Journal of Food Science&Technology，2002，37（2）：153-161.

[3]郭长江，韦京豫，杨继军，等.66种蔬菜、水果抗氧化活性的比较研究[J].营养学报，2003，25（2）：203-207.

[4]杨冬梅.莲藕抗氧化特性研究[D].杭州：浙江大学，2007.

[5]Hu M，Skibsted L H.Antioxidative capacity of rhizome extract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nuficera）[J]. Food Chemistry，2002，76（3）：327-333.

[6]严守雷.莲藕多酚提取分离鉴定及生物活性研究[D].武汉：华中农业大学，2003.

[7]Mukherjee P K，Saha K，Pal M，et al.Effect of Nelumbo nucifera rhizome extract on blood sugar level in rats[J].Journal of Ethnopharmacology，1997，58（3）：207-213.

[8]Mukherjee P K，Saha K，Balasubramanian R，et al.Studies on psychopharmacologicaleffectsofNelumbonuciferaGaertn. rhizome extract[J].Journal of Ethnopharmacology，1996，54（2-3）：63-67.

[9]Yang W M，Shim K J，Choi M J，et al.Novel effects of Nelumbo nucifera rhizome extract on memory and neurogenesis in the dentate gyrus of the rat hippocampus[J].Neuroscience Letters，2008，443（2）：104-107.

[10]王清章，彭光华，金悠，等.莲藕中酚类物质的提取分析及酶促褐变底物的研究[J].分析科学学报，2004，20（1）：38-40.

[11]刘焕云，刘月英，陈延峰，等.莲藕皮多酚的提取及抗氧化性能研究[J].林产化学与工业，2011，31（2）：87-90.

[12]陈晨，胡文忠，田沛源，等.超声辅助提取香蕉皮多酚工艺优化及其抗氧化性的分析[J].食品科学，2014，35（2）：12-17.

[13]李青，张名位，张瑞芬，等.5种籼稻品种谷壳中游离态和结合态酚类物质含量及其抗氧化活性比较[J].中国农业科学，2012，45（6）：1150-1158.

[14]Yang B，Zhao M，Shi J，et al.Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp[J].Food Chemistry，2008，106（2）：685-690.

[15]李映.莲藕藕节鞭质提取纯化及其抗氧化活性研究[D].武汉：华中农业大学，2009.

[16]Carrera C，Ruiz-Rodríguez A，Palma M，et al.Ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from grapes[J]. Analytica Chimica Acta，2012，732：100-104.

Extraction optimization and antioxidant evaluation of polyphenol from lotus root

QIN Hai-ming，AI You-wei，YI Yang*
（College of Food Science&Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

The effects of ethanol volume percent，material-to-solvent ratio，pH，extraction temperature and time on the extraction yield of polyphenol were investigated by single-factor experiment.Then，ethanol volume percent，material-to-solvent ratio，pH and extraction time were selected to establish the regression mathematical model with four factors.Based on response surface analysis and practical consideration，the optimized conditions were confirmed to be follows：ethanol volume percent was 40%，material-to-solvent ratio was 1∶22（g/mL），pH was 3 and extraction time was 72min.Accordingly，the predicted polyphenol yield was 0.22%，the tested polyphenol yield was 0.23%.Under these conditions，the yield of crude polyphenol extract was 1.12g/100g fresh weight，and the polyphenol content in the extract was 19.73mg GAE/100mg dry weight.The crude polyphenol extract showed application prospect as a natural antioxidant because of significant antioxidant activities involving in the IC50value of DPPH free radical scavenging was 351.56μg/mL，the IC50value of ABTS free radical scavenging was 308.80μg/mL，the FRAP antioxidant ability was 0.21mg TE/mg extract.

lotus root；polyphenol；extraction；antioxidant acivity

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.044

2014－05－12

覃海明（1994-），女，本科，研究方向：莲藕功能成分分析评价。

易阳（1986-），男，博士，讲师，研究方向：果蔬活性成分。

武汉轻工大学校立科研项目（2013D16、2013RZ03）。