苹果枝条多酚分离纯化及其抗氧化活性研究

陈玮琦，郭玉蓉，*，张　娟，张晓瑞

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

苹果枝条多酚分离纯化及其抗氧化活性研究

陈玮琦1，郭玉蓉1，*，张娟2，张晓瑞3

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

研究了6种大孔树脂对苹果枝条多酚的吸附性能，筛选出分离苹果枝条多酚的最佳树脂为X-5，进一步研究X-5大孔树脂纯化多酚的工艺条件和技术参数。所得最佳纯化工艺为：上样浓度为1mg/mL，流速为1.0BV/h，pH5.0，以70%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为2.0BV/h。在此条件下，所得苹果枝条多酚的纯度为72.36%，提取率为0.82%。对纯化后的苹果枝条多酚抗氧化活性进行研究，结果表明：苹果枝条多酚具有较强的还原能力，对羟基自由基、DPPH自由基具有良好的清除能力。

苹果枝条，多酚，大孔树脂，抗氧化

中国是世界最大的苹果生产国，在东北、华北、华东、西北和四川、云南等地均有栽培，栽培面积近189万平方公里，我国苹果的栽培面积和产量分别占世界总栽培面积和总产量的37%和40%，每年由于果树修剪等原因产生大量的苹果树枝和叶片得不到广泛的综合利用[1]。苹果枝条中含有大量的多酚类物质，其中根皮苷的含量高达64.32mg/g[2]；研究表明，根皮苷具有良好的防辐射，抑制脂肪氧化[3]、改善记忆力及美容美白等功效，并且对治疗糖尿病、代谢综合症及神经性疾病也有良好疗效[4-5]，现已被广泛应用到医学、食品行业及化妆品行业。

现今多酚的提取方法日益精进，大多使用有机溶剂得到的粗提物中多酚的纯度较低。使用粗提物为原料进行应用，因有效成分含量较低而影响其发挥应有生理活性。大孔树脂是一种多孔性高分子吸附分离材料，比表面积很大，具有选择性强、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等优点[6]。近几年来在多酚类物质的分离纯化中应用越来越广泛，Lijun Sun等[7]利用大孔树脂分离纯化苹果幼果多酚，纯化后，多酚纯度增加一倍。大孔树脂还被应用于纯化葡萄籽多酚[8]和石榴皮多酚[9]，均表现出较好的分离纯化效果。本文以苹果枝条为原料研究了6种大孔树脂对苹果枝条多酚的吸附及解吸性能，同时采用亚铁还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）法、DPPH法及清除的羟基自由基（·OH）的方法初步研究苹果枝条多酚的抗氧化活性，为实现其工业化连续生产提供可靠的理论依据和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

冬季修剪（2012年11月中旬）的苹果枝条采摘自陕西省咸阳市礼泉县；AB-8、X-5、NKA-9、D101、D110、D4020 6种大孔吸附树脂西安晶博生物有限公司；邻二氮菲、邻苯三酚天津光复精细化工研究所；没食子酸标准品、福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2，2-Diphenyl-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]美国sigma公司；其余所用试剂均为分析纯。

WFJ2100型可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；LAC164型电子分析天平梅特勒—托利多（上海）仪器有限公司；FW100型高速万能植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；DD-5M型医用离心机长沙平凡仪器仪表有限公司；GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2实验方法

1.2.1苹果枝条提取物的制备准确称取苹果枝条干粉100.00g，加入70%乙醇溶液（料液比为1∶10），超声波辅助提取45min，过滤，另加入70%乙醇溶液提取，总共提取3次，合并滤液并将滤液减压蒸发至无醇味，4000r/min离心20min，取上清液，储存于0～4℃冰箱中，备用。

1.2.2大孔树脂的预处理将AB-8、X-5、NKA-9、D101、D110、D4020大孔树脂依次用一定量纯净水漂洗，再用95%乙醇浸泡活化24h，后用蒸馏水冲洗至无醇味，用2～3倍树脂体积的5%盐酸溶液浸泡，后用水洗到接近中性，再用2～4倍树脂体积的5%氢氧化钠溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性，湿法装柱。

1.2.3大孔树脂的筛选准确称取经预处理的6种树脂各3.000g，放置于磨口具塞三角瓶中，准确加入100mL浓度为47.5μg/mL的苹果枝条多酚提取液，吸附24h，取滤出后的树脂，加入70%的乙醇溶液100mL置于室温振荡洗脱2h，采用Folin-Ciocalteu法[10]测定吸附液和洗脱液中总酚浓度，按照以下公式计算其吸附量、洗脱率、吸附率，综合评价所选6种树脂的吸附洗脱性能，最终筛选出最适宜的树脂进行后续实验研究[11]。

其中：Q为吸附量，mg/g；R为树脂的吸附率，%；T为树脂的解析率，%；C0为起始时的质量浓度，mg/mL；Ce为平衡时的质量浓度，mg/mL；V为吸附液的体积，mL；W为加入树脂的质量，g；C1为解吸液的质量浓度，mg/mL；

1.2.4静态吸附、洗脱实验

1.2.4.1树脂静态吸附动力学研究称取经筛选后的树脂3.000g，加入总多酚浓度为2.0mg/mL的苹果枝条多酚提取液100mL，24h内每1h取一次样测定剩余液体中的总多酚含量，通过计算树脂的吸附量绘制树脂对多酚的吸附量随时间的变化曲线。

1.2.4.2提取液pH对吸附效率的影响调节100mL总酚含量为2.0mg/mL的苹果枝条多酚提取液的pH分别为2、3、4、5、6、7、8，各加入筛选出的树脂2.000g，静置于室温下吸附24h，使之达到吸附平衡，然后测定不同pH下树脂的吸附量。

1.2.4.3乙醇浓度对洗脱效果的影响准确称取8份经预处理的湿树脂2.000g，置于150mL具塞三角瓶中，分别加入100mL总酚含量为4.750mg/g的苹果枝条多酚提取液，置于室温下静态吸附24h，待达吸附平衡后，计算吸附量。分别以浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%（v/v）的乙醇溶液100mL室温下振荡洗脱2h，达吸附平衡后通过测定洗脱液中的总酚含量来比较不同浓度乙醇溶液的洗脱效果。

1.2.4.4温度对洗脱效果的影响准确称取8份经预处理的湿树脂1.000g，置于150mL具塞三角瓶中，各加入总多酚含量为4.750mg/g的多酚提取液50mL，于室温下静态吸附24h，使之达到吸附平衡，测定吸附液中总酚含量，计算吸附量，过滤达到吸附平衡的树脂，用蒸馏水洗去表面残留的多酚溶液，再以浓度为70%（v/v）的乙醇溶液100mL在20、30、40、50、60、70℃下振荡洗脱30min，通过测定洗脱液中总酚含量计算洗脱率，比较温度对洗脱效果的影响。

1.2.5动态吸附、洗脱实验

1.2.5.1多酚溶液上柱流速对吸附效果的影响将浓度为1.0mg/mL的多酚提取液，分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5BV/h的流速进入柱体积约为500mL的X-5树脂柱中进行吸附实验，每隔一定柱体积的流出液，测定收集点上多酚的浓度。

1.2.5.2多酚溶液上柱浓度对吸附效果的影响将浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的多酚提取液，以1.0BV/h的流速进入柱体积约为500mL的X-5树脂柱中进行吸附实验，每隔一定柱体积的流出液，测定收集点上多酚的浓度。

1.2.5.3洗脱流速对洗脱效果的影响将500mL浓度为1.0mg/mL，pH为5.0的多酚提取液，用60%的乙醇分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0BV/h的流速进行洗脱，考察洗脱流速对洗脱效果的影响。

1.2.6苹果枝条多酚体外抗氧化活性实验

1.2.6.1总还原力的测定在10mL试管中分别加入不同浓度（20、40、60、80、100μg/mL）的苹果枝条多酚溶液1mL，PBS（0.2mol/L，pH=6.6）0.5mL和0.3%铁氰化钾1.5mL，置于50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸10mL，混匀后准确吸取上清液2mL，加入0.5mL 0.3%三氯化铁溶液，摇匀后在700nm处测定吸光值[12]。

1.2.6.2对羟自由基的清除作用采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2[13]法，将1.5mL不同浓度多酚溶液加入1.5mL PBS（0.2mol/L，pH=7.4）、1.5mL邻二氮菲溶液（1mmol/L）、1mL硫酸亚铁（1.5mmol/L）溶液和0.01%的过氧化氢溶液的混合液中，再加入蒸馏水将体积补至6mL，然后将各试管摇匀放入37℃恒温水浴锅中保温1h后测定其在509nm处的吸光值。各管对羟基自由基的清除率（SA）按下式计算：

SA（%）=（A1-A2）/（A0-A1）×100

式中：A0表示未损伤管（1.5mL的磷酸盐缓冲液+ 1.5mL邻二氮菲溶液+1mL硫酸亚铁溶液）；A1表示损伤管（1.5mL的磷酸盐缓冲液+1.5mL邻二氮菲溶液+ 1mL硫酸亚铁溶液+1mL的样品溶液+1mL双氧水溶液）；A2表示样品管（1.5mL的磷酸盐缓冲液+1.5mL邻二氮菲溶液+1mL硫酸亚铁溶液+1mL双氧水溶液）；SA为样品对羟基自由基的清除率，%。

1.2.6.3对DPPH自由基的清除作用配制60μmol/L的DPPH乙醇溶液，取2mL DPPH溶液，分别加入0.2mL不同浓度苹果枝条多酚溶液，摇匀，置于25℃水浴中反应15min后取出，测定525nm波长下的吸光值，以2mL 50%乙醇作为空白对照管，以2mL 50%乙醇代替DPPH溶液作为样品参比管，并以等体积蒸馏水和50%乙醇混合溶液空白调零测定其吸光值[14]。各管对DPPH的清除率（SA）按照下式计算：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）]/Ac×100

其中：SA表示对自由基的清除率，%；Ai表示样品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度；Aj表示未加DPPH溶液的样品溶液的吸光度；Ac表示未加样品时DPPH溶液的吸光度。

苹果枝条多酚抗氧化性实验均选用VC和BHT为阳性对照。

1.3数据处理和统计方法

以上实验均做三次重复。实验结果采用“SPSS 13.0”统计软件进行数据分析，Excel软件制表绘图。

2　结果与分析

2.16种大孔吸附树脂对苹果枝条多酚的吸附和解吸性能

综合分析表1可知，X-5树脂在所选的6种大孔树脂中的吸附率和洗脱率最高，可选择X-5树脂为最佳吸附分离载体。D101树脂的吸附率及解析率最小，此现象说明大孔树脂对苹果枝条多酚的吸附有较强的选择性，吸附能力的大小与树脂的类型有关。综合考虑，选用X-5树脂对苹果枝条多酚进行分离纯化。

表1　6种大孔吸附树脂的物理参数和吸附及解吸性能Table.1　Comparison of physical index and adsorption-desorption properties of six resins

2.2静态吸附、洗脱实验

2.2.1X-5树脂吸附曲线绘制由图1可以看出，X-5树脂在0～5h内对苹果枝条多酚的吸附量随着时间的延长不断增加，8h以后，随着时间的继续延长，解析率变化不大，此时因X-5大孔树脂吸附近饱和，基本上达解吸平衡状态。

图1　X-5树脂吸附曲线Fig.1　Absorbing curve of X-5 resin

2.2.2提取液pH对吸附效果的影响提取液pH对X-5树脂静态吸附的影响如图2所示。苹果枝条多酚溶液的pH对树脂的吸附有较大影响，当多酚溶液的pH为5.0时，树脂对苹果枝条多酚的吸附量达最大。X-5树脂对苹果枝条多酚的吸附率呈先升高后下降的趋势，这可能是因为在微酸性环境下，酚类物质以分子态存在，易于被识别并吸附，而在碱性的环境中，酚类物质多转变为离子状态，不利于树脂吸附[15]。因此，选择pH为5.0为宜。

图2　样品溶液pH对X-5树脂吸附效果的影响Fig.2　Influence of sample solution pH on absorbingcharacteristics of X-5 resin

2.2.3乙醇浓度对X-5树脂洗脱效果的影响由图3可知，树脂的洗脱率随乙醇浓度的升高而升高，当乙醇浓度高于60%后洗脱率基本恒定，乙醇水溶液是一种良好的解吸剂。高浓度的乙醇虽有利于多酚的释放，但同时也提高了生产成本，综合考虑，选择70%乙醇水溶液为合适的洗脱剂对树脂动态吸附、洗脱进行研究。

图3　乙醇浓度对洗脱效果的影响Fig.3　Influence of ethanol concentration on eluting effect

2.2.4温度对X-5树脂洗脱效果的影响图4显示的是X-5树脂对苹果枝条多酚吸附率随温度变化而变化的结果。树脂的动态洗脱率随温度的增加而升高，X-5大孔树脂在运输贮存及使用过程中应保持5～45℃环境中，避免过热过冷，如图4可见大于50℃时洗脱率基本不发生改变，但考虑到生产成本升高温度对其洗脱率贡献不大，故实验条件选择为室温（25±2℃）。

图4　温度对洗脱效果的影响Fig.4　Influence of temperature on eluting effects

2.3动态吸附、洗脱实验

2.3.1上柱多酚溶液流速对吸附效果的影响由图5可以看出，随着流出液体积的增大，流出液中残留的多酚物质也逐渐增加，这表明树脂对提取液中多酚的吸附百分比逐渐降低；随着流速的增大，多酚的漏过率也逐渐增大，吸附百分比下降的速率也逐渐升高，这表明较高的流速不利于多酚在树脂上的吸附。且当流速为0.5BV/h时，流出液中残留的多酚物质少于流速为1.0BV/h残留的多酚物质，故将流速控制在1.0BV/h较好。

2.3.2上柱多酚溶液的浓度对吸附效果的影响图6反映了不同浓度下流出液中多酚含量随流出液体积的变化。从图6可以看出，随着苹果枝条多酚提取液浓度的增大，流出液中残留的多酚含量不断增加；在较低浓度时，流出液中多酚的含量一直维持在一个较低水平，吸附百分比较高。因此，选择较低的溶液浓度（1mg/mL）进行吸附，可获得良好的吸附效果。

图5　流速对X-5树脂吸附效果的影响Fig.5　Influence of sample flow on absorbing effects of X-5 resin

图6　多酚溶液浓度对X-5树脂吸附效果的影响Fig.6　Influence of sample concentration on absorbing effects of X-5 resin

2.3.3洗脱流速对洗脱效果的影响洗脱流速对洗脱效果的影响如图7所示，由图7可知，洗脱流速越小其洗脱效果越好。可能是由于流速过快洗脱剂未与被吸附的多酚物质充分接触就流出，从而造成洗脱率较低。当流速为1BV/h时，洗脱率可达86.6%。但是洗脱的速率过慢，花费时间较长，效率低。综上所述，选择洗脱流速2BV/h为宜。

图7　洗脱流速对洗脱效果的影响Fig.7　Effect of eluent rate on desorption property

根据以上条件进行验证，得到苹果枝条多酚的纯度为72.36%，提取率为0.82%。

2.4苹果枝条多酚体外抗氧化性功能实验

2.4.1苹果枝条多酚总还原能力苹果枝条多酚、BHT和VC的总还原能力如图8所示，在选取的实验浓度范围内（20～100μg/mL），随着质量浓度的增加，其总还原力也随之增加，说明苹果枝条多酚、BHT及VC在适宜的浓度范围内均有较好的总还原能力，且苹果枝条多酚的总还原能力显著高于（p＜0.05）VC和BHT。BHT的总还原能力最弱。当浓度为100μg/mL时，苹果枝条多酚反应生成物在700nm处的吸光值分别是VC和BHT的1.2倍、2.03倍，综上所述，苹果枝条多酚具有较强的总还原能力。

图8　样品、BHT和VC的总还原能力Fig.8　Total reducing power of sample，BHT and VC

2.4.2苹果枝条多酚对DPPH·的清除能力DPPH·（二苯三硝基苯肼）是一种有机自由基，具有稳定性好、操作简便等优点，近年来被广泛应用于评价物质的抗氧化活性或筛选自由基清除剂[16]。分别选择20、40、60、80、100μg/mL这5个质量浓度的苹果枝条多酚、BHT和VC进行清除DPPH·实验，结果如图9所示，苹果枝条多酚，BHT和VC均具有清除DPPH自由基的作用，且随质量浓度的增加而增强。BHT的清除作用低于VC和苹果枝条多酚，苹果枝条多酚和抗坏血酸的清除能力相接近，差异不显著（p＞0.05）。在实验浓度范围内，苹果枝条多酚的清除率最高达到97%，表现出良好的清除效果。

图9　样品、BHT和Vc对DPPH·自由基的清除作用Fig.9　Scavenging effects of sample，BHT and VCon DPPH·radical

2.4.3苹果枝条多酚对羟基自由基的清除能力羟基自由基（·OH）是需氧生物代谢过程中生成的具有强氧化能力的氧自由基，因此可用清除羟自由基能力来反映受试物抗氧化性的强弱，大量研究[17-18]表明，自由基会造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，进而导致生物衰老和疾病的发生。苹果枝条多酚、BHT和VC对羟基自由基的清除能力如图10所示。从图10中可知，苹果枝条多酚和所选阳性对照对羟基自由基的清除率随着质量浓度的增加而提高。在实验浓度范围内（20～100μg/mL），苹果枝条多酚对羟基自由基的清除率由31%上升到70%，高于BHT对羟基自由基的清除率，低于VC的清除率。

图10　样品、BHT和VC对羟基自由基的清除作用Fig.10　　Scavenging effects of sample，BHT and VCon hydroxyl free radical

3　结论

本研究选用苹果树枝为原料，通过分析6种大孔树脂的吸附特性，筛选出X-5型树脂为苹果枝条多酚分离纯化树脂。上柱条件：上柱液多酚浓度1mg/mL，最佳pH为5，上柱液流速为1.0BV/h；解析条件：洗脱液体积分数为70%乙醇溶液，洗脱液流速为2.0BV/h。在此条件下，所得苹果枝条多酚的纯度为72.36%，提取率为0.82%。采用树脂分离苹果枝条多酚具有得率高、成本低、操作简单、易于工业化生产等优点。

苹果枝条多酚在实验浓度范围内具有良好的抗氧化能力，其总还原力为VC和BHT的1.20倍、2.03倍，枝条多酚浓度为100μg/mL时，对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为97%和70%，表现出良好的清除效果。

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Study on the extraction and purification of polyphenols from apple branch and their antioxidative activities

CHEN Wei-qi1，GUO Yu-rong1，*，ZHANG Juan2，ZHANG Xiao-rui3
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Adsorption and desorption properties of six kinds of macroporous resins were evaluated for isolation and purification of total polyphenols from apple branches.The results showed that X-5 resin was verified to offer the best adsorption capacity and desorption ratio for total polyphenols among the six macroporous resins investigated.Influential factors，such as pH and concentration of feeding solution，strippant，and adsorption isotherm polyphenols，were successively investigated on X-5 resin.The optimum technology were as follows， the sample concentration was 1mg/mL，the adsorption flow rate was 1BV/h，pH of the extracted solution was 5.0，the strippant was 70%ethanol，the elution flow rate was 2BV/h.Under the optimum conditions，the purity of total polyphenols increased to 72.36%and the yield was 0.82%.Antioxidative activities of purified polyphenol extracts from apple branches were also studied.The results indicated that polyphenol extracted from apple branches had a strong total reducing power activity and the free radical scavenging abilities on·OH，DPPH·were excellent.

apple branch；polyphenol；macroporous resin；antioxidation

TS201.2

B

1002-0306（2015）04-0231-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.042

2014－06－04

陈玮琦（1989-），女，硕士研究生，主要从事食品功能成分开发及利用方面的研究。

郭玉蓉（1962-），女，博士，教授，主要从事食品生物加工方面的研究。

农业部现代苹果产业技术体系建设专项基金资助（CARS-28）。