以线虫为模型评价唾液乳杆菌延长寿命及对相关生理活动的影响

范金波，侯　宇，蔡茜彤，周素珍，冯叙桥

（渤海大学食品科学研究院辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

以线虫为模型评价唾液乳杆菌延长寿命及对相关生理活动的影响

范金波，侯宇，蔡茜彤，周素珍，冯叙桥

（渤海大学食品科学研究院辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

利用秀丽隐杆线虫，评价了三株唾液乳杆菌对线虫寿命及生理功能的影响。结果表明唾液乳杆菌可以显著延长秀丽线虫寿命，寿命延长率为11.9%（p＜0.05），且延缓衰老作用不是由于唾液乳杆菌菌株与标准菌株大肠杆菌OP50革兰氏分类的差异，并且与菌株的生长氧需求和对宿主的毒性无关。此外，饲喂唾液乳杆菌在延长线虫寿命的同时显著影响线虫的摄食及生长情况，显著提高线虫的呼吸强度及体内SOD活性（p＜0.05），表明唾液乳杆菌的抗衰老活性可能是通过能量限制效应而达到的。研究结果为唾液乳杆菌抗衰老研究提供了新的证据，为抗衰老益生菌产品的开发奠定了基础。

唾液乳杆菌，秀丽隐杆线虫，衰老，能量限制

衰老是机体组织器官功能随年龄增长而发生的退行性变化[1]，是机体各种生化反应的综合表现。越来越多的研究专注于寻找具有抗衰老作用的物质。益生菌安全性高，分离纯化成本低，如果能够明确抗衰老功能，其作为抗衰老产品的前景将十分广阔。已有国内外的学者对益生菌这方面的功能开展研究，Kimoto-Nira等对SAMP6早衰小鼠进行连续11个月饲喂Lactococcus lactis G50热致死菌体，结果表明能够改善衰老所致的体重降低[2]；Kaburagi等对C57BL6/n衰老小鼠饲喂Lactobacillus johnsonii La1 14d，结果表明能增强小鼠T细胞免疫功能[3]。综上所述已有研究表明饲喂益生菌具有降低实验动物体内氧化水平，增强免疫功能，延缓与衰老相关的生理表征等作用。然而目前益生菌抗衰老功能研究尚存在以下不足：研究多是利用老龄动物，或是利用基因手段构建的早衰动物为模型，实验动物不是处于正常的生理状态下，而且也没有进行益生菌全程饲喂干预，缺少直接的寿命数据；因此，需要利用一种新型的实验模型开展研究。

秀丽隐杆线虫，学名Caenorhabditis elegans，简称C.elegans[4-5]。将线虫应用于益生菌抗衰老功能研究主要有以下几方面优势：线虫以细菌为食，适合进行益生菌抗衰老功能研究；线虫寿命短，平均寿命为20d左右，能够进行全程饲喂益生菌，得到直接的寿命数据。因此，针对唾液乳杆菌延长寿命及调节生理功能尚不明确这一问题，本研究以秀丽隐杆线虫为模型，评价唾液乳杆菌对线虫寿命的影响，同时评价了对线虫相关生理活动的影响，为唾液乳杆菌抗衰老功能提供新证据。

1　材料与方法

1.1确材料与仪器

琼脂粉日本协和株式会社；Bacto Peptone细菌蛋白胨美国BD公司；5-FUdR 5-氟-2’-脱氧尿苷美国Sigma-Aldrich公司；SOD测定试剂盒南京建成生物技术公司；厌氧液体培养基（AB）、MRS培养基北京陆桥公司；秀丽隐杆线虫虫株野生型Caenorhabditis elegans N2，北京生命科学研究所惠赠；菌种线虫标准食物E.coli OP50，北京生命科学研究所惠赠；实验菌株Lactobacillus salivarius subsp. salivarius FDB89、FDB86、FDB81由实验室自行分离（保藏号CGMCC 2263、3606），冻干后保存于-80℃；为了排除唾液乳杆菌与标准食物大肠杆菌革兰氏分类及生长氧需求的差异，用实验室保存的革兰氏阳性厌氧菌Clostridium perfringens C01（CLP）作为对照菌。

ZSA301体视显微镜重庆光学仪器厂；TL-16G台式高速离心机上海安亭科学仪器厂；THZ-C电热恒温培养箱江苏太仓实验仪器厂；SCIENTZ-IID超声波细胞破碎仪宁波新芝生物科技公司；DK-98-II2KW洁净工作台天津泰斯特仪器公司；UV-2102PC紫外可见分光光度计上海UNICO公司；Model-680酶标仪美国BIO-RAD公司；ZDX35BI高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1唾液乳杆菌对线虫衰老影响首先对线虫进行同期化处理。向平板中加入2mL M9缓冲液（3g KH2PO4，15.12g Na2HPO4·12H2O，5g NaCl，加蒸馏水定容至1L，121℃灭菌15min，冷却至室温后无菌加入1mL 1mol/L MgSO4，混匀），用无菌吸管吹打，尽量冲下平板上的虫体，将虫体转移至1.5mL离心管，800×g离心1min，弃上清收集虫体。加入1mL新鲜的线虫裂解液（1mL 8mol/L NaOH，0.6mL 9%次氯酸钠溶液，3.4mL无菌水，混匀），立刻漩涡振荡10s，800×g离心1min，移液器吸走上清，重复2次，最后管内剩余约100μL卵/M9悬浊液。使用无菌吸管将虫卵滴加于涂布OP50的NGM平板，25℃培养，约12h之后于体视显微镜下可见大量L1期幼虫活动，证实同期化成功。

同期化48h后的线虫，置于体视显微镜观察，使用铂金铲挑取生殖口为透明半月形的L4期雌雄同体虫于涂布不同受试菌的mNGM平板，每块平板挑取10只，每个受试菌挑取6块平板，平板置于25℃培养进行标准寿命实验。每天观察线虫生存状况，如虫体对铂金铲轻触没有活动反应则认为虫体死亡，将其挑除平板并进行记录死亡数目。排除失踪、体内孵化及非自然死亡线虫。全部线虫死亡则实验结束。寿命延长率是相对对照组OP50组寿命而计算出的相对延长率，具体计算方法如下：

寿命延长率（%）=（实验组的线虫寿命-OP50组线虫寿命）/OP50组线虫寿命×100

1.2.2唾液乳杆菌对线虫生理活动的影响线虫虫体大小的测定。使用铂金铲挑取同期化后L4期雌雄同体线虫于涂布不同菌的mNGM平板，每板挑取1只，每种菌挑10块平板，25℃培养。将挑虫当天记为0d，在0～6d每天将平板置于生物显微镜下，放大40倍，以数码相机拍摄每条线虫图片，同时拍摄同等放大倍率下的标尺用于定义单位长度。实验结束后，使用Image J软件，按照软件说明，分析图片中线虫轮廓，计算线虫的投影面积，用以表示线虫虫体大小。

线虫咽泵频率的测定。使用铂金铲挑取同期化后L4期雌雄同体线虫于涂布不同菌的mNGM平板，每板挑取1只，每种菌挑10块板。25℃培养24h之后，将平板置于生物显微镜，放大100倍，使用数码摄像机跟踪拍摄每只线虫1min内的咽泵活动情况短片，每只线虫独立拍摄3次。将短片导入电脑，使用视频播放软件以0.25×播放速率播放短片，记录1min内线虫咽泵活动次数，作为咽泵频率。

1.2.3唾液乳杆菌对线虫代谢活动的影响线虫呼吸作用强度的监测（XTT法）。使用水溶性四氮唑盐XTT（2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-甲酰胺内盐），按照Braeckman等[6]方法，监测线虫线粒体琥珀酸脱氢酶活性，以此评价饲喂不同菌株对线虫呼吸作用强度的影响。在96孔酶标板中依次加入95μL H2O、5μL线虫裂解物、50μL NADH和NADPH混合溶液（浓度均为2mmol/L，溶解于0.1% NaHCO3溶液）、100μL 0.5mg/mL XTT溶液，置于微量振荡器混匀后，保鲜膜覆盖，置于25℃孵育1h，于酶标仪测定490nm吸光值。根据XTT摩尔吸光系数[7]，计算虫体裂解物中每毫克蛋白每小时XTT的摩尔还原能力，用以表征线虫呼吸作用强度。从第0～8d，隔天测定1次，每样品做3次平行。

线虫体内SOD活性测定。使用SOD试剂盒，按照说明书测定线虫裂解物SOD活性，结果表示为每毫克蛋白SOD活力单位。从第0～8d，隔天测定1次，每样品做3次平行。

1.3数据统计分析

使用SPSS 16.0对实验数据进行统计分析。采用ANOVA结合Duncan’s Test比较分析饲喂不同菌线虫较咽泵频率的差异；比较各时间点线虫虫体大小、呼吸作用强度、SOD活性的差异，p＜0.05认为具有显著性差异。

2　结果与分析

2.1唾液乳杆菌对线虫衰老影响

标准寿命实验结果显示，饲喂不同菌株菌体对线虫寿命的影响不同。如图1和表1所示。饲喂唾液乳杆菌FDB89可以显著延长线虫寿命，寿命延长率为11.9%；饲喂FDB81对线虫寿命有一定的延长作用，但是与线虫标准食物OP50相比差异不显著；饲喂FDB86使线虫寿命明显缩短。这一结果与Ikeda等的报道相似[8]，在其研究中报道了3株乳杆菌及2株长双歧杆菌菌株均可以延缓线虫衰老，且菌株之间寿命延长率有差异，其寿命延长率在17%～33%之间。

已有研究表明，线虫标准食物的OP50对线虫有轻微毒性，尤其在线虫处于老龄阶段时，免疫系统功能下降，OP50菌体在线虫体内繁殖会加速线虫衰老死亡过程，将OP50热致死处理之后，菌株及毒性产物失活，线虫寿命会显著延长[8]。本研究中所用唾液乳杆菌FDB89及OP50均经热灭活处理，唾液乳杆菌FDB89在此条件下仍可以显著延长线虫寿命，证实其延寿作用与其对宿主低毒力无关。研究中设置的另一个对照菌株梭状芽胞杆菌CLP是革兰氏阳性厌氧菌，然而饲喂该菌的线虫并没有表现出延寿表型，证实唾液乳杆菌FDB89的延寿作用与菌株革兰氏分类及生长氧需求情况无关。

图1　饲喂不同菌株的线虫生长曲线Fig.1　Survival curve of C.elegans fed by different bacteria

表1　饲喂不同菌株线虫平均寿命Table.1　The mean lifespan of C.elegans fed by different bacteria

2.2唾液乳杆菌对线虫生理活动的影响

2.2.1唾液乳杆菌对线虫生长情况的影响从成虫第0d开始，连续监测线虫虫体大小，用以评价唾液乳杆菌对线虫生长情况的影响。如图2所示，在实验第0～6d间，线虫虫体逐渐长大。通过比较不同时间点虫体大小结果，证实饲喂FDB81、FDB86、FDB89的线虫在所有时间点虫体大小与OP50比较均显著降低（p＜0.05），表明饲喂FDB81、FDB86、FDB89影响了线虫生长，饲喂对照菌株CLP不影响线虫生长。

2.2.2唾液乳杆菌对线虫摄食活动的影响通过记录线虫咽泵频率，评价饲喂唾液乳杆菌对线虫摄食活动的影响。如图3所示，饲喂不同菌株线虫的咽泵频率皆在200次/min左右，与文献报道正常线虫频率吻合[9-10]。方差分析表明饲喂FDB89、FDB81、FDB86都显著降低线虫咽泵频率（p＜0.05），饲喂CLP对线虫咽泵频率影响不显著。此结果一方面说明，线虫对本研究中不同菌株摄入存在偏好，摄入量存在差异；另一方面，唾液乳杆菌摄入速率与OP50有显著差异证实唾液乳杆菌饲喂线虫可能存在摄食限制情况。

图2　饲喂不同菌株线虫虫体大小变化Fig.2　Changes of body size of C.elegans fed by different bacteria

能量限制（CR）是一种有效延缓生物体衰老的方法，其延寿效应在酵母、线虫、果蝇直到高等的啮齿类、灵长类动物都有直接的实验证据证明[11]。能量限制在延缓动物衰老、延长寿命的同时，一般会造成生长停滞、动物体重降低、生殖能力下降等效应[12-13]。目前认为产生能量限制效应有两种产生方式：减少能量摄入和摄入CR模拟物。减少能量摄入可以在不产生严重饥饿的情况下，通过降低动物食物摄入量（一般降为正常摄入量的60%～80%）或降低摄入食物总能量水平实现。而CR模拟物是一类不需要限制能量摄入即可激活体内CR相关响应靶点，使机体出现能量限制延寿表型的物质。本研究证实饲喂唾液乳杆菌的线虫咽泵频率明显减低，虫体生长缓慢，我们推断，唾液乳杆菌可能通过能量限制延缓线虫的衰老。

图3　饲喂不同菌株线虫的咽泵频率Fig.3　Pharyngeal pumping rate of C.elegans fed by different bacteria

2.3唾液乳杆菌对线虫代谢活动的影响

2.3.1唾液乳杆菌对线虫呼吸作用强度的影响从第0d开始，连续监测线虫XTT还原能力，用以评价唾液乳杆菌对线虫呼吸作用的影响。如图4所示，随着培养时间延长，线虫逐渐衰老，其体内呼吸作用强度呈逐渐下降趋势。饲喂不同菌株对线虫呼吸作用强度有显著影响，在成虫第2、4d，与对照组相比，饲喂不同菌株均显著提高线虫呼吸强度（p＜0.05），但之后各组之间无显著差异。表明不同菌株会影响线虫体内能量代谢水平，且不同菌株不同时间的效应不同。

2.3.2唾液乳杆菌对线虫体内SOD活性的影响如图5所示，随着培养时间延长，线虫体内SOD活性呈逐渐上升趋势。与OP50相比，饲喂4种菌株均显著提高了线虫体内SOD活性（p＜0.05）。表明唾液乳杆菌可以提高线虫体内的抗氧化能力，激活线虫体内防御体系，高活性的SOD清除体内的活性氧自由基，保护大分子不受损伤，从而延长线虫寿命。

图4　饲喂不同菌株线虫XTT还原能力的变化Fig.4　Changes of XTT reduction of C.elegans fed by different bacteria

图5　饲喂不同菌株线虫体内SOD活性的变化Fig.5　Changes of SOD of C.elegans fed by different bacteria

3　结论

以秀丽隐杆线虫为模型，在评价唾液乳杆菌对线虫寿命影响的同时，首次研究了其对线虫生长、摄食、呼吸作用、体内关键抗氧化酶活性等正常生理活动的影响。结果表明，唾液乳杆菌具有延寿作用且FDB89延寿作用显著强于FDB81、FDB86。同时，唾液乳杆菌能显著影响线虫正常生理功能，提高线虫呼吸作用强度及体内关键抗氧化酶SOD活性，证实了其延寿作用与菌株的革兰氏分类、生长氧需求及对宿主毒性无关，可能是通过能量限制延缓线虫的衰老。这一结果为唾液乳杆菌抗衰老功能提供新的证据，为研究其抗衰老机制奠定了重要基础。

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Extending life span effects of Lactobacillus saliva in Caenorhabditis elegans

FAN Jin-bo，HOU Yu，CAI Xi-tong，ZHOU Su-zhen，FENG Xu-qiao
（Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

In this study，we studied anti-aging effects of Lactobacillus salivarius using C.elegans as model，and the anti-aging mechanism of Lactobacillus salivarius was also clarified.The results showed that feeding Lactobacillus salivarius significantly extended the mean life span of C.elegans by up to 11.9%（p＜0.05），compared to that of control nematodes.The reduced pharyngeal pumping rate，growth，and increased superoxide dismutase（SOD）activity and XTT reduction capacity were also observed in Lactobacillus salivarius feeding worms（p＜0.05），indicating that anti-aging activity of Lactobacillus salivarius may be associated with energy restriction.Our study provided the direct evidence for the anti-aging function of Lactobacillus salivarius，and formed the foundation for developing the anti-aging probiotics.

Lactobacillus salivarius；Caenorhabditis elegans；aging；caloric restriction

TS255.1

A

1002-0306（2015）04-0136-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.020

2014－05－23

范金波（1977-），男，博士，讲师，主要从事食品生物化学方面的研究。