秋葵多糖与α-淀粉酶的相互作用及光谱学分析

张首玉，周婧琦，李少华，孙　艳，高愿军

（1.河南职业技术学院烹饪食品系，河南郑州450046；2.漯河食品职业学院，河南漯河463200；3.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001）

秋葵多糖与α-淀粉酶的相互作用及光谱学分析

张首玉1，周婧琦2，李少华1，孙艳2，高愿军3，*

（1.河南职业技术学院烹饪食品系，河南郑州450046；2.漯河食品职业学院，河南漯河463200；3.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001）

研究秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制作用，并运用紫外光谱对其相互作用的光谱进行探讨，结果表明，秋葵多糖对α-淀粉酶具有较强的抑制性，且随其浓度的增加而增强，其抑制类型属于竞争可逆型。经过紫外光谱分析表明，随着秋葵多糖浓度的不断增加其吸收峰逐渐增强且发生蓝移，证明秋葵多糖与α-淀粉酶混合时彼此之间发生了作用。

秋葵多糖，淀粉酶，抑制作用，光谱

秋葵富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、多糖、黄酮类等化合物，属于低脂肪、低热量、无胆固醇的食药两用营养保健新型蔬菜，具有极高的药用保健功能，如降血糖、抗疲劳、利尿、健胃、抗菌、抗氧化、抗诱变止血等[1]。作为一种天然的药物资源，秋葵在食品以及保健品行业具有着广阔的开发前景。

多糖作为秋葵的功能成分之一与其具有的部分生物活性有着密切的联系，已有研究证实，经高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6小鼠，秋葵可以降低其血糖和血脂。α-淀粉酶是一种与糖脂代谢密切相关的酶类，对α-淀粉酶抑制作用的研究是探讨降糖降脂作用机理的有效手段之一[2]。经研究显示，α-淀粉酶抑制剂属于糖苷水解酶抑制剂中的一种，它能有效抑制唾液淀粉酶和胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，从而起到降低血糖和血脂的作用[2]，但关于秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制效应还未见报道。本实验研究秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制机理，为进一步研究秋葵多糖的降糖降脂效应提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

秋葵市售；α-淀粉酶、阿卡波糖生化试剂；无水乙醇、盐酸、碘、碘化钾、可溶性淀粉、丙酮、氯化钠分析纯。

AL240电子天平梅特勒-托里仪器有限公司（上海）；UV-200紫外分光光度计龙尼柯仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；SHZ-6循环水式多用真空泵河南省英峪中华仪器厂；PHS-3C酸度计上海理达仪器厂；Scientz-10N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司；HC-3618R高速冷冻离心机安徽中科科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1秋葵多糖的制备[3]用蒸馏水清洗新鲜秋葵嫩荚，将其放于冷冻干燥机-80℃干燥后磨成粉状。采用纤维素酶的方法浸提，用80%的无水乙醇4℃冷藏醇沉过夜，离心收集沉淀，运用Sevage法脱除蛋白，经大孔树脂AB-8进一步纯化，冷冻干燥得秋葵多糖（RPS1）备用。

1.2.2酶活力的测定方法参考国标GB 8275-2009对样液进行配制[4]，采用碘-淀粉呈色法测定。

取α-淀粉酶和秋葵多糖溶液各0.5mL将其混匀，在37℃恒温水浴锅中反应30min，加入可溶性淀粉溶液1mL，再在水浴锅中预热15min后用浓度为2mol/L的盐酸溶液0.3mL中止反应，用4mL蒸馏水稀释摇匀，立即将反应液加入到预先盛有0.2mL稀碘液的试管中，摇匀，以不加多糖溶液作为空白对照，在660nm波长下测定其OD值。根据式（1）计算样品的酶活力。

式中：X—样品酶活力，U/mg；c—测试的样液浓度，mg/mL；n—加入抑制剂体积，mL。

1.2.3淀粉标准曲线的制作分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL质量浓度的可溶性淀粉标准溶液，在试管内分别加入上述标液1mL置于37℃恒温水浴锅中反应30min，再在水浴锅中预热15min后用浓度为2mol/L的盐酸溶液0.3mL中止反应，用4mL蒸馏水稀释摇匀，立即将反应液加入到预先盛有0.2mL稀碘液的试管中，摇匀，以蒸馏水作为空白对照，在660nm波长下测定其吸光值，以可溶性淀粉质量浓度作为横坐标，吸光值作为纵坐标，绘制可溶性淀粉溶液的标准曲线。

1.2.4秋葵多糖浓度对α-淀粉酶抑制效应的影响

以阿卡波糖对α-淀粉酶活性的抑制作为对照实验。分别称取不同质量纯化后的秋葵多糖和阿卡波糖配制成不同浓度的溶液，运用1.2.2酶活力的测定方法测量其对α-淀粉酶活性的抑制影响，抑制率的计算如式（2）所示。

式中，I—抑制率，%；T1—抑制剂活力，U/mg；T2—酶活力，U/mg。

1.2.5秋葵多糖与α-淀粉酶作用时间对酶抑制效应的影响分别在秋葵多糖浓度0.5mg/mL和阿卡波糖浓度0.35mg/mL下，与α-淀粉酶作用不同的时间，根据1.2.2酶活力的测定方法，在pH为7室温条件下测定其OD值，计算抑制率，研究秋葵多糖对酶抑制活性的影响。

1.2.6不同pH条件下秋葵多糖对酶活性的抑制影响

秋葵多糖浓度0.5mg/mL，以阿卡波糖（0.35mg/mL）作为对比实验，室温下静置5min，根据1.2.2酶活力的测定方法，研究不同pH对酶活性的抑制影响。

1.2.7秋葵多糖对α-淀粉酶抑制效应的研究固定底物的浓度为0.5mg/mL的α-淀粉酶，分别加入其质量为0、10、20、30、40、50μL，根据1.2.2酶活力的测定方法，研究不同浓度下的秋葵多糖抑制α-淀粉酶酶活力随底物浓度的变化情况，以α-淀粉酶的加入量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制抑制效应曲线。

1.2.8秋葵多糖对α-淀粉酶抑制类型的研究根据1.2.2酶活力的测定方法，加入定量50μL的α-淀粉酶，改变其质量浓度，研究不同浓度下秋葵多糖的酶活力随底物浓度的变化规律，以Lineweaver-Burk双倒数作图，绘制秋葵多糖对α-淀粉酶抑制作用的动力学曲线，判断其抑制类型。

1.2.9秋葵多糖与α-淀粉酶相互作用的紫外光谱分析根据抑制作用强、中、弱分别取秋葵多糖溶液浓度0.1、0.45、0.6mg/mL与α-淀粉酶混匀置于37℃恒温水浴锅中15min，在波长为180～600nm范围内进行紫外光谱扫描。

1.3数据处理

实验中的图表均采用Excel、SPSS软件进行了处理与分析，每处理重复3次。

2　结果与讨论

2.1淀粉标准曲线的绘制

可溶性淀粉溶液的标准曲线如图1所示。

从图1可以看出，回归方程为y=1.2556x+0.0214（R2=0.9966），说明淀粉质量浓度在0.1～0.7mg/mL区间线性关系良好。根据淀粉标准曲线方程得酶活力的计算公式如式（3）所示。

式中：OD1—加入抑制剂后的吸光值；OD2—只加α-淀粉酶时的吸光值；n—所加抑制剂体积，mL。

2.2秋葵多糖浓度对α-淀粉酶抑制效应的影响

不同浓度的秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制率见图2。

从图2可以看出，作为阳性对照实验的阿卡波糖对α-淀粉酶具有较强的抑制作用，秋葵多糖对α-淀粉酶也具有一定的抑制作用，但抑制率低于阿卡波糖，在0.1～0.5mg/mL浓度范围内，秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制作用呈现出一定的量效关系，随其浓度的增加抑制作用增强，当多糖溶液的浓度达到0.5mg/mL时，抑制率达到约80%且趋于恒定。

图2　秋葵多糖浓度对酶抑制效应的影响Fig.2　Effect of okra polysaccharide with different concentration on the inhibiting activity of enzyme

2.3秋葵多糖与α-淀粉酶作用时间对酶抑制效应的影响

根据图3实验结果，分别配制其最大抑制率浓度依次为阿卡波糖溶液浓度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液浓度0.5mg/mL，研究它们各自与α-淀粉酶反应时间的长短对其抑制率的影响，结果见图3。

图3　秋葵多糖与酶作用时间对酶抑制效应的影响Fig.3　Effect of different reaction time on the inhibiting activity of enzyme

由图3可知，作为阳性对照实验的阿卡波糖在5min内，抑制率就达到了82%，说明其在短时间内能与α-淀粉酶迅速有效地结合，表现出较强的抑制性。而秋葵多糖与α-淀粉酶的结合能力明显低于阿卡波糖，当抑制率达到78%时，随着反应时间的延长其抑制率基本处于稳定，所需时间约15min。由此可知，秋葵多糖对α-淀粉酶具有一定的抑制作用，但其作用时间较长，抑制能力低于阿卡波糖。

2.4不同pH条件下秋葵多糖对酶活性的抑制影响

分别配制阿卡波糖溶液浓度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液浓度0.5mg/mL，研究它们在不同pH条件下对α-淀粉酶活性的抑制影响，结果见图4。

从图4可以看出，对照实验阿卡波糖在不同pH条件下对α-淀粉酶的量效曲线基本接近直线，因此在酸碱环境下呈现良好的剂量依赖性。秋葵多糖在pH1～6范围内，对α-淀粉酶的抑制作用相对稳定，抑制率一直保持在一恒定的范围；当pH7～12时，秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制作用逐渐减弱，抑制率不断降低。可见，秋葵多糖在酸性环境下对α-淀粉酶表现出了较强的抑制活性，但在碱性环境中，抑制作用有所下降。

图4　不同pH条件秋葵多糖对酶抑制效应的影响Fig.4　Effect of pH on the inhibiting activity of enzyme

2.5秋葵多糖对α-淀粉酶抑制效应的影响

判定对酶的抑制作用类型可逆与否，除了用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法看能否除去抑制剂来区别外，还可以采用酶抑制动力学方法判断[5]。以加酶量分别为0、10、20、30、40、50μL的条件下，根据1.2.2酶活力的测定方法，研究不同抑制作用强度的秋葵多糖（0、0.45、1mg/mL）时对α-淀粉酶的抑制率，判断其抑制效应，结果见图5。

图5　秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制效应Fig.5　The depression effect of α-amylase by okra polysaccharide

从图5可以看出，α-淀粉酶加酶量与其摄入后OD值作图得到一系列通过原点的直线，随着秋葵多糖浓度的增加，其直线斜率逐渐降低，秋葵多糖对α-淀粉酶活力的抑制作用不断加强，符合可逆抑制作用的特点[6]。所以，秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制类型属于可逆抑制。

2.6秋葵多糖对α-淀粉酶抑制类型的动力学测定

将浓度分别为0、0.25、1mg/mL的秋葵多糖溶液作为α-淀粉酶的抑制剂[S]，测定不同底物浓度的α-淀粉酶酶促反应的抑制速率[V]即OD值。以1/[S]作为横坐标，1/[V]作为纵坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数动力学曲线，如图6所示。

从图6可以看出，3条不同质量浓度的秋葵多糖溶液对α-淀粉酶抑制作用的动力学曲线均为不通过原点的直线，当加入秋葵多糖抑制剂后，抑制速率V并未发生很大的变化，但随着所需底物浓度明显地增加，其抑制速率逐渐增大，即米氏常数Km增大，其抑制机理呈现出典型的竞争性抑制类型，说明秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制作用属于竞争性抑制。由于秋葵多糖属于竞争性抑制剂，又与酶的结合是可逆的，因而可通过增加底物浓度，提高底物竞争力的办法，消除竞争性抑制剂的抑制作用，从而使酶促反应速率接近或达到最大值。

图6　秋葵多糖对α-淀粉酶抑制类型的动力学分析Fig.6　The kinetic analysis of inhibition type on α-amylase by okra polysaccharide

2.7秋葵多糖与α-淀粉酶相互作用的紫外光谱分析

将不同浓度的秋葵多糖与α-淀粉酶混匀置于37℃恒温水浴锅中反应15min，在波长为180～600nm范围内进行紫外光谱扫描，结果见图7。

图7　秋葵多糖与α-淀粉酶的紫外光谱分析Fig.7　The UV spectra of okra polysaccharide and α-amylase

由图7可知，α-淀粉酶在290nm附近有紫外吸收峰，这主要是由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）光吸收以及与酶构象和螺旋有关的相互作用所引起[7-8]。随着秋葵多糖浓度的不断增加，其吸收峰逐渐增强且发生蓝移。这说明秋葵多糖与α-淀粉酶混合时相互之间发生了作用，改变了酶分子中Trp和Tyr所处空间结构的微环境，从而引起了α-淀粉酶最大紫外吸收波长和强度的改变[9]，使其构象发生了改变。

3　结论

秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制作用弱于阿卡波糖，但仍表现出较强的抑制作用，且随其浓度的增加抑制作用增强，当溶液浓度达到0.5mg/mL时，抑制率达到80%。此外，秋葵多糖对α-淀粉酶的作用时间较长，抑制能力略低于阿卡波糖。秋葵多糖在酸碱环境下均表现出了较好的剂量依赖性，在酸性环境下其对α-淀粉酶具有较强的抑制作用，但在碱性环境中，其抑制作用有所下降。秋葵多糖对α-淀粉酶的抑制类型属于竞争可逆型。通过紫外光谱分析，随着秋葵多糖浓度的增加，其吸收峰逐渐增强且发生蓝移，说明秋葵多糖与α-淀粉酶之间发生了作用。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草[M]．上海：上海科学技术出版，1999：4322-4323．

[2]吕风霞，陆兆新．α-淀粉酶抑制剂的研究进展[J]．食品科学，2002，23（3）：152-154．

[3]高愿军，幸美佳，周靖琦，等．2种方法提取秋葵多糖工艺研究[J]．食品科技，2013，38（11）：189-192．

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.GB 8275-2009食品添加剂α-淀粉酶制剂[S].北京：中国标准出版社，2009.

[5]曾阳，郭凤霞，陈振宁，等．沙棘粗多糖对α-葡萄糖苷酶活性影响及酶动力学的研究[J]．药物分析杂志，2012，32（12）：2154-2157．

[6]蒋立科，高继国．普通生物化学教程[M]．北京：化学工业出版社，2008：129-133．

[7]刘雯，裘晓丹，雷芳，等．茶碱对胰α-淀粉酶的抑制类型及光谱性质[J]．天然产物研究与开发，2008，20：298．

[8]Roberfroid M，Roberftiod MB，Delzenne N M，et al．Dietary fructans[J]．Annu Rev Nutr，1998，18：117．

[9]周向军，高义霞，郑晓蕙，等．高乌甲素对α-淀粉酶及其光谱性质的影响[J]．时珍国医国药，2013，24（3）：550-551．

Effect of okra polysaccharide on α-amylase inhibition and its spectral analysis

ZHANG Shou-yu1，ZHOU Jing-qi2，LI Shao-hua1，SUN Yan2，GAO Yuan-jun3，*
（1.Department of Tourism＆Cooking，Henan Polytechnic，Zhengzhou 450046，China；2.Luohe Food Vocational College，Luohe 463200，China；3.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China）

The effects of okra polysaccharide on α-amylase and its UV spectra were studied in the test.The results showed that okra polysaccharide had strong inhibition ability on α-amylase，the increase of its concentration，and could lead to reversible competitive inhibition.Moreover，UV spectra showed that okra polysaccharide induced a blue shift of α-amylase warelength，and increased with the increase of its concentration.These results provided that interaction occured when mixed between the okra polysaccharide and α-amylase.

okra polysaccharide；α-amylase；inhibition；UV spectra

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0101-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.013

2014－05－26

张首玉（1972-），女，本科，副教授，研究方向：食品营养及食品安全。

高愿军（1957-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工与贮藏。

漯河市科技计划项目（2014071）。