EGFP 转基因小鼠建系及其脊髓源神经干细胞应用前景的探讨

李 宵 王春芳＊ 李鹏飞 王 晶 闫肖卿 田 峰

（1山西医科大学实验动物中心；实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室；2山西医科大学科研实验中心，太原030001）

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein， EGFP），是1962年由Shimomura等从美国西海岸的一种水母中分离纯化出的蛋白质，在体外可以经适当的激发光激发后发出绿色荧光［1］。Shimomura、Marin Chalfie和Roger Y.Tsien于2008年因为发现并发展了EGFP而获得了诺贝尔化学奖。EGFP蛋白用途广泛，可以用于分子标记［2］、药物筛选、融合抗体、蛋白标记等，尤其用来观察细胞的位置及动态的变化［3－6］，在实验前不需要固定染色，可以在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行观察分析。由于EGFP标记过程无创，分子量很小，并可以在多种生物体内表达，不扰乱生物正常生长和功能，已广泛应用与转基因生物的建立。

eEGFP是EGFP的突变型，发生了双氨基酸取代，荧光强度为EGFP的35倍［7］，可以更好的观察及应用。我们希望构建一种可以稳定表达eEGFP的转基因小鼠，在清洁级环境下培养并繁殖建系，为之后的小鼠细胞标记提供各组织器官的EGFP细胞来源。

材料和方法

1.试剂和仪器

实验中所需的c57／bl6小鼠购于山西医科大学实验动物中心，所有操作均符合伦理学要求。

Gateway©BPClonaseTMII Enzyme Mix，Gateway©LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix（invitrogen），QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN），TIANprep Mini（TIANGEN），Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，GeneRulerTM100bp DNA Ladder（Fermentas），PrimeSTARTMHS DNA Polymerase（Takara），BIO－RAD PCR 仪 （PTC－220／ALS－1296G／ALD1244G）；电泳仪 DYY－12，水平电泳槽DYCP－31DN（北京市六一仪器厂）；UV transilluminator（UVP）；小型离心机（Eppendorf）；；风热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；恒温水浴锅（HENGAO）；全温空气摇床（上海福玛实验设备有限公司）。

2.载体的构建

首先利用重叠PCR扩增得到attB1－eEGFP－attB2，反应终止后，在1%的琼脂糖凝胶中电泳。紫外下切出所需条带，参照QIAquick的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收。然后，将回收的attB1－eEGFP－attB2利用 Gateway clone技术，BP反应3h得到pDown－eEGFP，并将产物转化到大肠杆菌Stb13中。将转化物涂到含有50μg／ml Kan的LB平板上，37℃孵育过夜后，挑取阳性克隆提取质粒，并使用琼脂糖凝胶电泳检测是否有相应条带出现。最后，将所得到的pDown－EGFP和母载体PRP.Des2dLR反应3h，得到最终的表达载体PRP.Ex2d－EF1A＞eEGFP。将表达载体转化到Stb13。筛选并挑取出阳性克隆，提取DNA，PCR后琼脂糖凝胶电泳检测是否有相应条带出现。

3.转基因小鼠的制作

首先取多只雄性小鼠实施输精管切除手术，饲养两周确定手术成功后取一只与1－2只雌鼠合笼饲养，制作假孕母鼠。同时将正常小鼠交配，获得正常受孕的母鼠，从受孕母鼠体内取出受精卵，使用DNA显微注射法，将之前构建的EGFP表达载体注入受精卵原核，然后移植入假孕的母鼠输卵管，待其自然产下小鼠。

4.转基因小鼠的鉴定

建立转基因小鼠期间通过荧光定量PCR方法鉴定其基因型，将离乳期小鼠剪下约1cm鼠尾，提取DNA，PCR后采取琼脂糖凝胶电泳检测。建系期间采取双向鉴定的方法，荧光定量PCR检测后观察阳性小鼠紫外照射是否会发出绿色荧光，及紫外照射发出荧光后荧光定量PCR鉴定其基因型是否符合。鉴定引物 F：ACGTAAACGGCCACAAGTTC，R： GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC。

取一只阳性EGFP转基因小鼠麻醉，心脏灌注后取心、脑、肺、肾、肝、脾、骨骼肌、脊髓，修剪成合适大小，常规脱水后石蜡包埋。石蜡切片机5μm连续组织切片，脱蜡后不加处理直接放于荧光显微镜下，观察阳性小鼠的组织是否可以发出绿色荧光。

5.转基因小鼠的建系

通过PCR将建立的4只原代转基因小鼠间及与野生型小鼠间进行配种繁殖，得到的阳性子代间继续交叉配种繁殖。全部过程于屏障环境中进行，期间送检微生物与寄生虫。

6.转基因小鼠身长及体重的测定

待小鼠长至两个月时，随机挑取10只转基因小鼠及相同环境饲养的10只野生型c57小鼠，测量身长和体重。数据用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

7.建系后转基因小鼠神经干细胞的培养

取一孕龄为13－14d的转基因小鼠，麻醉后常规消毒母鼠腹部。开腹后取出子宫，转移至平皿中，D－Hanks液冲洗。剪开子宫外膜取出胎鼠，剥离胎鼠脊髓，并剥去脊髓外膜，放入D－Hanks中吹打至脊髓消失液体浑浊。将浑浊液体1500r／min离心5min，弃上清，加入含EGF、FGF各20ng／ml的DMEM／F－12培养基后充分混匀后转移至培养瓶中，放于37℃5%的CO2孵箱中培养，每3d半量换液。将培养三代的神经干细胞吹打混匀后吸出200 μl涂于载玻片上，不加处理，于荧光显微镜下观察。

结 果

1.载体的构建

图1A为PCR扩增attB1－EGFP－attB2，该PCR产物条带理论大小约为722bp，对图谱中相应大小的条带进行切胶回收。图1B为菌落PCR筛选pDown－eEGFP，产物条带理论大小为956bp，与目的条带大小相符的克隆即为阳性克隆。图1C为菌落PCR筛选PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP，产物条带理论大小为720bp，与目的条带大小相符的克隆即为阳性克隆，说明载体构建成功。可将提取到的DNA用于显微注射。

图1 A PCR鉴定attB1－EGFP－attB2凝胶电泳分析结果。图1B PCR鉴定pDown－eEGFP凝胶电泳分析结果。图1C PCR鉴定PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP凝胶分析结果Fig.1AThe electrophoresis analysis of attB1－EGFP－attB2.Fig.1BThe electrophoresis analysis of pDown－eEGFP.Fig.1CThe electrophoresis analysis of PRP.Ex2d－EF1A＞EEGFP.

2.转基因小鼠的制作及鉴定

转基因小鼠共制作成功4只，两雌两雄。

图2为传代转基因小鼠鉴定琼脂糖凝胶电泳结果图，PCR扩增产物条带为440bp。此图中Mark－er为DL500，最亮处为200bp，可见400bp与500bp间有相应条带出现。如图所示，紫外照射发出绿色荧光的小鼠PCR检测全部为阳性。

。

图2 PCR鉴定转基因阳性小鼠凝胶电泳分析结果。Fig.2The electrophoresis analysis of transgene positive mice.

将EGFP转基因新生小鼠直接放于紫外下照射，可发现阳性小鼠皮肤会发出绿色荧光，而阴性小鼠不发荧光显黑色。成年小鼠毛发无活细胞不分泌蛋白不发荧光，耳、爪、尾等裸露皮肤的部位有绿色荧光。

图3 A 新生小鼠阴性与阳性在紫外灯下的对比。图3B 成年阳性小鼠与阴性小鼠在紫外下的对比。Fig.3AComparison of negative and positive new born mouse by ultraviolet lightFig.3BComparison of negative and positive adult mouse by ultraviolet light

由荧光照片观察可知，EGFP转基因小鼠的各组织切片中细胞所在部位在蓝色激发光下均可观察到绿色荧光，不同细胞之间荧光强度会有不同，结缔组织等不分泌蛋白部位不发光。说明固定包埋等常规处理后不会影响荧光的发生。

图4 A肺组织荧光照片100×图4B肝脏组织荧光照片100×图4C脑组织荧光照片100×图4D脾脏组织荧光照片100×图4E肾脏组织荧光照片100×图4F心肌组织荧光照片400×图4G骨骼肌荧光照片400×图4H脊髓组织荧光照片100×Fig.4AFluorescent photographs of lung 100×Fig.4BFluorescent photographs of kidney 100×Fig.4CFluorescent photographs of brain 100×Fig.4DFluorescent photographs of spleen 100×Fig.4EFluorescent photographs of liver 100×Fig.4FFluorescent photographs of myocardial 400×Fig.4GFluorescent photographs of Skeletal Muscle 400×Fig.4HFluorescent photographs of spinal cord 100×

图4A为肺组织荧光照片。可见有大量肺泡，气管壁细胞发出较强荧光。图4B为肝脏组织荧光照片，可见肝组织呈条索状。图4C为脑组织荧光照片，可见较为明显的3层结构。图4D为脾脏组织荧光照片。图4E为肾脏组织荧光照片。可见近端小管、远端小管、集合管，并可见肾小球。图4F为心脏组织荧光照片。图4G为骨骼肌横切面荧光照片。图4H为脊髓横切面荧光照片，看见白质与灰质发出不同强度荧光，有较为明显的界限。在灰质中可观察到较亮的运动神经元。

3.转基因小鼠的建系

转基因小鼠生长状态稳定，和野生型小鼠无明显行为学区别。经过两年的繁殖，现已有400余只小鼠，其中阳性有274只。繁殖过程中发现4代后小鼠已有一窝全部都为阳性的现象，目前新生小鼠阳性率已经大于80%。转基因小鼠饲养在隔离环境下，经微生物与寄生虫检测符合清洁级实验动物要求。

图5 A为1号雌鼠所繁殖后代的家系谱图。图5B为3号雌鼠家系谱图。Fig.5APedigree trees of transgenic mouse.5BPedigree trees of No3transgenic mouse

4.身长及体重的测定

如表所示，可见转基因小鼠与野生型小鼠相比，体重之间与身长之间的差异无统计学意义，可以说明转基因小鼠基本生理数据与野生型小鼠无明显差异，EGFP基因不会干扰小鼠的正常生长。

表1 EGFP小鼠与野生型小鼠身长体重的对比Table 1 Comparison of length and weight in EGFP mouse and wild mouse

5.建系后转基因小鼠培养脊髓源神经干细胞的观察

所培养细胞使用神经干细胞标记蛋白Nestin免疫组织细胞染色，图6A可以发现视野中细胞球呈绿色荧光，说明所培养出的细胞球呈Nestin抗原阳性，即为神经干细胞。图6B为Hochest对细胞核的染色，蓝色荧光部位说明有细胞核的存在。

将培养的3代神经干细胞涂于载玻片上置于荧光显微镜下观察，可见视野内神经干细胞散在分布，由于未贴壁，细胞呈较为规则的圆形。所见细胞在激发光下均发出绿色荧光，其中大块绿色为神经干细胞球。

图6 A 神经干细胞的Nestin鉴定细胞浆呈阳性40×。图6B 神经干细胞细胞核的Hochest染色40×。Fig.6AFluorescent images of NSCs was showed the cytoplasm immunopositive for Nestin 40×.Fig.6BFluorescent images of NSCs was showed the nucleus immunopositive for Hochest40×.

图7 三代神经干细胞荧光照片40×。Fig.7 Fluorescent photographs of three generation neural stem cells 40×

图7 A为第一代的神经干细胞，镜下观察可见细胞较为分散，单个细胞体积较小，神经球数目不多。图7B为第二代体外培养的神经干细胞，可见细胞体积增大，并有较小的神经球产生。图7C为第三代细胞，可见有大量神经球产生。观察三代神经干细胞的荧光照片，发现荧光强度无明显变化，不会因体外培养传代而衰减。

讨 论

细胞标记是细胞生物实验中常用的方法之一，是为了追踪多细胞系统中某种特定细胞的作用和行为，使用前将该特定细胞通过特殊手段处理，观察时使用一定方法处理可以与未标记细胞区分。实验室目前将细胞标记多用于细胞移植治疗［8－9］，可监测其在体内的生长状态，增殖分化情况等。

EGFP标记是目前实验室中最为常用的一种活体细胞标记手段，而且化学性质稳定，多聚甲醛固定及石蜡包埋处理后不会影响荧光的检测。可以在蓝色激发光下不做任何处理直接观察，不会影响细胞的完整性和活性，观察后可继续培养细胞。因此是一种理想的细胞标记物。但荧光蛋白标记法操作复杂，过程繁琐，病毒载体构建困难，对实验人员要求较高，不利于实验过程的顺利进行。由于EGFP本身是从动物体内提取的一种蛋白，对细胞及生物体毒性弱，这就为EGFP转基因动物提供了基础。c57是实验室中常用的一种近交系实验小鼠，细胞培养时的取材及多种动物实验均会用到该品系，因此我们构建了c57EGFP转基因小鼠。当需要某种细胞时，可直接从转基因小鼠提取，提取及培养方法与普通细胞一致，不需任何额外操作，即可获得已标记EGFP的细胞，省去了细胞培养后标记的复杂操作，同时降低了转染试剂对细胞的额外影响，并保证了转染效率。

根据文献其他实验室也有EGFP小鼠的制作，但未见建系的报道［10］。近交系小鼠拥有纯正的谱系，是实验动物标准化的一部分，并具有遗传基因位点纯合型、遗传组成的同源性、长期遗传的稳定性、遗传特征的稳定性、表型一致性、背景资料清楚等特点，不同国家和实验室的科学家可重复和验证以取得的数据，提高了实验结果的可比性。转基因小鼠制作过程中产生的第一代子鼠为嵌合体小鼠，在繁殖过程中会有野生型小鼠出生，因此我们将阳性小鼠互交，希望可以培育出EGFP的近交系转基因小鼠，完善转基因动物建设平台。在此过程中，我们希望通过对多代数进行观察，确定转入EGFP后对生物的后续影响。

通过我们的实验结果可知，EGFP转基因小鼠的各组织在多聚甲醛固定及石蜡包埋处理后，均可观察到所有细胞发出绿色荧光。说明转基因小鼠常见组织细胞可在蓝色激发光下发出绿色荧光，并且不受常规处理的干扰。但在观察中发现细胞荧光强度会有不同，我们认为荧光强度与细胞分泌蛋白的强度有关，下一步将会对不同组织的荧光蛋白做定量检测，分析产生的原因。因此，现已可将EGFP转基因小鼠作为实验室中所使用的一种工具鼠，用于细胞移植和细胞共培养等需要细胞标记的实验。

脊髓损伤是脊柱损伤的严重并发症，造成损伤平面以下感觉、运动功能的丧失，不仅给病人带来极大的痛苦，也给社会和家庭带来沉重的负担，其治疗一直是困扰人们的难题。目前的多项研究已经证实神经干细胞的移植为脊髓损伤的治疗提供了新的途径，已经成为目前研究脊髓损伤修复的一个热点。Cusimano M的研究表明，神经干细胞的注射治疗可以改变脊髓损伤后的微环境，可以修复损伤的轴突或使其再生［11］。移植入损伤部位的神经干细胞可以分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，连接损伤部位脊髓并重建神经传导通路，部分恢复损伤平面以下的运动及感觉功能［12，13］。本课题组之前的研究已经证实神经干细胞在脊髓损伤后具有修复作用，与对照组相比，神经干细胞注射组BBB评分更高，组织切片也说明细胞有更多的分裂分化［14］，但其在治疗过程中所产生作用的具体机制尚不清楚。因此需要了解神经干细胞注射入脊髓损伤部位后的生存状态，是自体分化为运动神经元，还是诱导体内细胞的自我分化。我们的研究已经证实，EGFP小鼠所培养的神经干细胞在体外多次传代后仍可在激发光下发出绿色荧光。因此，在后续的研究中，我们将从转基因小鼠的脊髓中培养获得的神经干细胞注射入脊髓损伤模型小鼠损伤部位后，在时间节点处死模型小鼠，常规处理后在荧光显微镜下观察注射细胞在小鼠体内的生存情况，并通过免疫组织化学确定注射细胞所处状态及分化情况，分析神经干细胞在体内发挥的作用，为神经干细胞在脊髓损伤修复中提供更加直观的理论依据。

［1］Shimomura O，Johnson FH，Saiga Y.Extraction，purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea.J Cell Comp Physiol，1962，59：223－239

［2］单志新，林秋雄，符永恒等.绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告分子筛选有效的siRNA.中国生物化学与分子生物学报，2007，23（3）：231－235

［3］Yang M，Baranov E，Moossa AR，et al.Visualizing gene expression by whole－body fluorescence imaging.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（22）：12278－12282

［4］Takada T，Iida K，Awaji T，et al.Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker.NatBiotechnol，1997，15（5）：458－461

［5］Yang M，Reynoso J，Jiang P，et al.Transgenic nude mouse with ubiquitous green fluorescent protein expression as a host for human tumors.Cancer Res，2004，64（23）：8651－8656

［6］Chung S，Andersson T，Sonntag KC，et al.Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines.Stem Cells，2002，20（2）：139－145

［7］Zhang G1，Gurtu V，Kain SR.An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells.Biochem Biophys Res Commun，1996，227（3）：707－711

［8］Wagner JP，Sullins VF，Dunn JC.Skin－derived precursors generate enteric－type neurons in a ganglionic jejunum.J Pediatr Surg，2014，49（12）：1809－1814.doi：10.1016／j.jpedsurg.2014.09.023.Epub 2014Oct 1

［9］Blaya MO，Tsoulfas P，Bramlett HM，et al.Neural Progenitor Cell Transplantation Promotes Neuroprotection，Enhances Hippocampal Neurogenesis，and Improves Cognitive Outcomes after Traumatic Brain Injury.Exp Neurol，2014，pii：S0014－4886（14）00384－7.doi：10.1016／j.expneurol.2014.11.014

［10］张敬之，郭歆冰，谢书阳等.用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠.自然科学进展，2006，16（5）：571－577

［11］Cusimano M，Biziato D，Pluchino S，et al.Transplanted neural stem／precursor cells instruct phagocytes and reduce secondary tissue damage in the injured spinal cord.Brain，2012，135（Pt 2）：447－460

［12］Tarasenko YI，Gao J，Nie L，et al.Human fetal neural stem cells grafted into contusion－injured rat spinal cords improve behavior.J Neurosci Res，2007，85（1）：47－57

［13］Du C，Yang D，Zhang P，et al.Single neural progenitor cells derived from EGFP expressing mice is useful after spinal cord injury in mice.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol，2007，35（4）：405－414

［14］张海滨，王春芳，李鹏飞等.小鼠脊髓损伤模型的建立及神经干细胞移植后运动功能恢复情况的研究.中国组织化学与细胞化学杂志，2014，23（2）：105－110