注射用牡荆素与葛根素注射液抗大鼠心肌缺血／再灌注损伤量效关系的研究

王亚男，彭成凤，2，甄毅岚，董六一

◇药学研究◇

注射用牡荆素与葛根素注射液抗大鼠心肌缺血／再灌注损伤量效关系的研究

王亚男1，彭成凤1，2，甄毅岚1，董六一1

目的研究牡荆素和葛根素对治疗实验性缺血再灌注大鼠心肌损伤的量效关系，探讨在抗心肌缺血再灌注损伤（MIRI）方面更为优效的治疗药物方法通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立MIRI模型，分别尾静脉注射给予5个剂量的注射用牡荆素（0．75、1．5、3、6、12 mg／kg）和葛根素注射液（3、6、12、24、48 mg／kg），记录大鼠各时期心电图ST段的变化，TTC染色检测大鼠心肌梗死面积，同时根据心肌梗死抑制率绘制量效曲线图，计算半数有效量（ED50）和95%可信区间（95%CI）结果与MIRI组比较，注射用牡荆素组在0．75～12 mg／kg剂量范围内及葛根素注射液组在3～48 mg／kg剂量范围对抑制大鼠心电图ST抬高、减小心肌梗死面积均呈剂量依赖性；注射用牡荆素和葛根素注射液对MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的ED50分别为5．321 mg／kg和32．950 mg／kg，95%CI分别为4．294～6．593 mg／kg和24．690～43．970 mg／kg结论注射用牡荆素对MIRI大鼠心肌梗死抑制率的ED50明显低于葛根素注射液，提示注射用牡荆素在防治MIRI方面可能是更为优效的药物。

牡荆素；葛根素；心肌缺血再灌注损伤；量效关系；半数有效量

目前，对急性心肌梗死的治疗是以梗死相关血管的早期再灌注为主［1］。随着梗死血管的再通，缺血心肌重新得到血流灌注，但同时并发心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI）［2］，加重患者的病情和预后。葛根素是从葛根中提取的黄酮类主要活性成分，具有抗氧化、抑制血栓形成、扩张冠脉血管及改善缺血心肌代谢等抗MIRI的保护作用［3］，现已广泛应用于临床，疗效较确切。牡荆素是从山楂叶中提取的黄酮类有效成分，研究［4－6］表明牡荆素具有抗氧化、对抗心肌肥厚和抑制血小板聚集等作用。此外，前期研究［7－9］显示，牡荆素对离体或在体大鼠MIRI具有良好的保护作用，同时对犬急性心肌缺血也具有保护作用。虽然牡荆素和葛根素对MIRI均有保护作用，但是对两者在缺血心肌保护作用的量效关系比较方面尚无系统研究。该研究通过建立大鼠在体MIRI模型，首次观察注射用牡荆素与葛根素注射液对MIRI大鼠心肌梗死抑制率及其量效关系的影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物SPF级SD大鼠，由安徽医科大学省级实验动物中心提供，230～250 g，雌雄各半。于（22±3）℃、40%～70%湿度范围下饲养，照明周期：12 h明／12 h暗。

1．2 药物与试剂注射用牡荆素（规格：30 mg／瓶，批号：20121216，纯度：99．5%，合肥七星医药科技有限公司，常温下保存，临用前用生理盐水稀释至所需浓度）；葛根素注射液（规格：2 ml／0．1 g，批号：20120709，北京四环科宝制药有限公司，常温下保存，临用前用生理盐水稀释成所需浓度）；水合氯醛（批号：20110322，上海白鹤化工厂）；TTC染料（批号：T8877，美国Sigma公司）；伊文思蓝（批号：WC20050331，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1．3 仪器与设备HX-200动物呼吸机、BL-420E生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；恒温电热水浴锅（上海医疗器械厂）；JA1203A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；动物天平（上海友声衡器有限公司）；MDF-192型超低温冰箱（日本三洋公司）；D300s单反相机（日本尼康公司）。

1．4 实验方法

1．4．1 大鼠在体MIRI模型的建立［10］大鼠称重后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰卧位固定。将电极插入大鼠四肢皮下，通过BL-420E生物机能实验系统连续记录心电图。于颈部正中切开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉并切开气管连接到动物呼吸机上（呼吸时比为1．5∶1．0，60次／min，潮气量20 ml）。于左锁骨中线切开大鼠皮肤，分离皮下组织及肌肉，在左第3、4肋骨间开胸，暴露心脏，打开心包膜，用6-0无损伤缝线在肺动脉圆锥左缘与左心耳下缘2 mm处轻轻进针经浅层心肌穿出，使左冠状动脉前降支位于其上，套上双层塑料套管，收紧扎线使前降支闭塞致急性心肌缺血。观察大鼠心电图出现R波增宽、ST段明显抬高及心脏局部紫绀，则视为心肌缺血。缺血30 min后抽出内层套管并松开线结，恢复前降支的血流即再灌注60 min。假手术组在实验中只穿线不结扎。

1．4．2 实验分组 将大鼠完全随机分为假手术组、MIRI组、注射用牡荆素5个剂量组（0．75、1．5、3、6、12 mg／kg）和葛根素注射液5个剂量组（3、6、12、24、48 mg／kg），每组10只。注射用牡荆素和葛根素注射液均于结扎冠状动脉5 min后和再灌注时给药，给药容积为5 ml／kg（尾静脉注射，分两次给药，每组总给药量不变），假手术组和MIRI组给等量的生理盐水。

1．4．3 心电图监测 在整个实验过程中，通过BL-420E生物机能实验系统连续记录大鼠心电图（Ⅱ导联）。比较各组大鼠基础状态、缺血30 min和再灌注60 min的心电图ST段变化。

1．4．4 心肌梗死面积测定 于再灌注60 min后再次结扎大鼠冠状动脉前降支，并立刻取出心脏，清除心腔内的淤血，经主动脉向心腔内注入0．25%伊文思蓝溶液，置于－80℃冰箱冻存。取出冷冻的心脏，从心尖到心基部将心脏平行切成5片2 mm的小片。用1%TTC（pH 7．4）溶液在37℃下温孵15 min，再用10%福尔马林固定后拍照。梗死区（infarction size，IS）的心肌为白色，缺血危险区（area at risk，AAR）的心肌为红色，IS和AAR的面积计算通过图象分析软件完成，用IS／AAR来表示心肌梗死面积。

1．4．5 心肌梗死抑制率和半数有效量（median effective dose，ED50）计算 心肌梗死抑制率（%）＝（MIRI组大鼠IS／AAR平均值－给药组大鼠IS／AAR平均值）／MIRI组大鼠IS／AAR平均值× 100%，根据心肌梗死抑制率绘制葛根素和牡荆素的量效关系曲线。采用GraphPad Prism 5软件系统，以心肌梗死抑制率和给药剂量的对数值计算ED50及95%CI。

1．5 统计学处理采用SPSS 15．0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），注射用牡荆素和葛根素注射液的ED50采用t检验比较。

2 结果

2．1 注射用牡荆素和葛根素注射液静脉给药对MIRI大鼠心电图的影响各组在缺血30 min及再灌注60 min时心电图ST段变化（ΔST）差异有统计学意义（F30min＝7．81，F60min＝9．27；P＜0．01）。其中，假手术组大鼠在整个实验的各时间点心电图ST段无明显变化。与假手术组比较，MIRI组的缺血30 min和再灌60 min的心电图ST段明显抬高，差异有统计学意义（P＜0．01）。与MIRI组比较，注射用牡荆素1．5、3、6、12 mg／kg组和葛根素注射液24、48 mg／kg组的缺血30 min和再灌60 min的心电图ST段有所降低，差异有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05），但仍然高于各组基础值。见表1。

表1 注射用牡荆素及葛根素注射液对MIRI大鼠心电图的影响（n＝10，±s）

与假手术组比较：＃＃P＜0．01；与MIRI组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别剂量（mg／kg）ΔST（mV）基础值缺血30 min再灌注60 min假手术－0．072±0．0150．092±0．0330．092±0．027 MIRI－0．089±0．0330．285±0．062＃＃0．308±0．070＃＃注射用牡荆素0．750．085±0．0330．269±0．0740．279±0．076 1．50．089±0．0180．232±0．0680．249±0．051*30．090±0．0360．210±0．053**0．232±0．054*60．083±0．0200．169±0．035**0．195±0．071**120．080±0．0170．153±0．040**0．161±0．051**葛根素注射液30．094±0．0380．260±0．0700．284±0．071 60．083±0．0360．250±0．0820．258±0．057 120．090±0．0360．236±0．0880．248±0．082 240．086±0．0300．204±0．074*0．232±0．065*480．087±0．0250．176±0．050**0．191±0．050**

2．2 注射用牡荆素和葛根素注射液静脉给药对MIRI大鼠IS／AAR的影响注射用牡荆素各组和葛根素注射液各组MIRI大鼠心肌组织TTC染色图片。见图1、2。经图像分析软件及方差分析处理后可知，各组IS／AAR差异有统计学意义（F＝34．76，P＜0．01）。MIRI组大鼠IS／AAR相比于假手术组显著增加，差异有统计学意义（P＜0．01）。注射用牡荆素1．5、3、6、12 mg／kg 4个剂量组的IS／AAR相比于MIRI组显著减小，其中12 mg／kg组大鼠心肌梗死范围较MIRI组降低了63．43%，差异有统计学意义（P＜0．01）。葛根素注射液6、12、24、48 mg／kg 4个剂量组的IS／AAR相比于MIRI组减小明显，其中48 mg／kg组大鼠心肌梗死范围较MIRI组降低了54．90%，差异有统计学意义（P＜0．01）。见表2。

表2 注射用牡荆素和葛根素注射液对MIRI大鼠IS／AAR的影响（n＝10，±s）

与假手术组比较：＃＃P＜0．01；与MIRI组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别剂量（mg／kg）IS／AAR（%）假手术－0 MIRI－35．72±5．73＃＃注射用牡荆素0．7529．89±6．95 1．525．36±4．59**3 22．18±4．92**6 16．15±3．39**1213．06±3．79**葛根素注射液331．86±6．16 6 28．95±5．75*1224．52±6．56**2418．97±5．62**4816．11±5．78**

2．3 注射用牡荆素和葛根素注射液静脉给药对MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的量效关系及对比分析 通过计算心肌梗死的抑制率得出，6 mg／kg注射用牡荆素与48 mg／kg葛根素注射液的心肌梗死抑制率分别为54．79%和54．90%，药效基本相当；3 mg／kg注射用牡荆素与12 mg／kg葛根素注射液的心肌梗死的抑制率分别为37．91%和31．35%，药效基本相当。根据牡荆素和葛根素对心肌梗死抑制率的量效关系曲线图，计算注射用牡荆素对心肌梗死抑制率的ED50为5．321 mg／kg，95%CI为4．294～6．593 mg／kg；葛根素注射液对心肌梗死抑制率的ED50为32．950 mg／kg，95%CI为24．690～43．970 mg／kg。通过显著性检验比较注射用牡荆素和葛根素注射液的ED50，结果显示注射用牡荆素对MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的ED50明显低于葛根素注射液的ED50（t＝5．84，P＜0．05）。见图3。

3 讨论

MIRI是指心肌在缺血的基础上恢复血流灌注后，组织损伤反而进行性加重的现象［2］。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支而造成的心肌缺血是目前应用最广的首选动物模型。该模型与急性心肌梗死患者的血流动力学和心肌代谢的改变等有着相似之处，且通过心电图和梗死心肌面积的测定较易确定心肌梗死的范围和损伤程度。本研究显示，在大鼠MIRI模型的基础上，注射用牡荆素与葛根素注射液均可抑制MIRI大鼠心电图ST段抬高，并可减小心肌梗死范围。其中，注射用牡荆素在0．75～12 mg／kg剂量范围内，对MIRI大鼠心肌梗死范围的抑制作用呈现明显剂量依赖效应。葛根素注射液在3～48 mg／kg剂量范围内，对MIRI大鼠心肌梗死范围的抑制作用也呈现一定的量效关系。

牡荆素和葛根素均是从中药材中提取的黄酮类化合物单体，关于牡荆素和葛根素对实验性MIRI的保护作用已有较多研究。本课题组前期药效学研究［8－9，11］显示，在抗MIRI疗效方面，在不同动物模型上低剂量的牡荆素即可达到相对较高剂量的葛根素的治疗效应。而在本研究中，通过分别考察5个不同剂量组的注射用牡荆素和葛根素注射液对MIRI大鼠心肌梗死抑制率的影响，发现两者在抗MIRI时疗效差异较大。1．5 mg／kg注射用牡荆素与12 mg／kg葛根素注射液，6 mg／kg注射用牡荆素与48 mg／kg葛根素注射液可达到的心肌梗死抑制率分别为29．00%和31．35%，54．79%和54．90%。即在相当的治疗效果下，牡荆素的给药剂量均低于葛根素，与前期药效学研究［8－9，11］结果一致。出现这种疗效差异的原因可能与两者的植物来源、化学结构差异以及作用机制不同等有关。有关牡荆素抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制有待进一步的深入研究。

ED50是指能引起50%的受试对象出现阳性反应时的药物剂量，其是药理学研究、毒理学研究以及食品安全性评价中的常用指标。在药理学研究中，ED50的值越小则表明药物安全度越高，常与半数致死量结合以评价药物的相对安全性。本研究中，注射用牡荆素和葛根素注射液对MIRI大鼠心肌梗死抑制率的ED50分别为5．321 mg／kg和32．950 mg／kg。即当两者对MIRI大鼠心肌梗死抑制率同为50%时，注射用牡荆素的给药剂量明显低于葛根素注射液的剂量，这表明在改善MIRI方面注射用牡荆素可能比葛根素注射液相对更为安全有效。

综上所述，注射用牡荆素与葛根素注射液均可降低MIRI大鼠心肌梗死范围，注射用牡荆素的ED50约为葛根素注射液的1／6，明显低于葛根素注射液，提示注射用牡荆素可能在防治MIRI方面是更为优效的药物。

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A study of dose-effect relationship between vitexin and puerarin injections on myocardial ischemia／reperfusion injury in rats

Wang Yanan1，Peng Chengfeng1，2，Zhen Yilan1，et al
（1Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Cardiology，Lu’an Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Lu’an 237000）

ObjectiveTo investigate the dose-effect relationship of vitexin and puerarin in the rat models with myocardial ischemia／reperfusion injury（MIRI），and explore the more effective treatment drugs in the aspects of MIRI．Methods The model of MIRI was carried out by ligation of left anterior descending coronary artery in rats．Five doses of vitexin（0．75，1．5，3，6，12 mg／kg）and puerarin（3，6，12，24，48 mg／kg）were administered via tailvein．The changes of ST-segment at different time and the infarct size of rat heart were determined by electrocardiogram and TTC staining，respectively．Draw the dose-effect curve based on the inhibition rate of myocardial infarction．Then，the median effective dose（ED50）and 95%confidence interval（95%CI）of vitexin and puerarin were calculated．Results Compared with MIRI group，vitexin within 0．75～12 mg／kg dose range and puerarin within 3～48 mg／kg dose range could inhibit the ST-segment elevation，reduce myocardial infarct size in a dose-dependent manner．ED50of vitexin and puerarin inhibition the rate of myocardial infarction were respectively 5．321 mg／kg and 32．950 mg／kg in the rat model with MIRI，95%CI were respectively 4．294～6．593 mg／kg and 24．690～43．970 mg／kg．Conclusion ED50of vitexin inhibition the rate of myocardial infarction was significantly lower than puerarin．It suggests that vitexin is probably more effective in the rat model with MIRI than puerarin．

vitexin；puerarin；myocardial ischemia／reperfusion injury；dose-effect relationship；ED50

R 286．2

A

1000－1492（2015）03－0314－05

2014－10－06接收

国家自然科学基金（编号：81470432）

1安徽医科大学药理学教研室，合肥 230032

2安徽医科大学附属六安医院心血管内科，六安 237000

王亚男，女，硕士研究生；董六一，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：dongly＠ahmu．edu．cn