rLukS-PV体外诱导人急性髓系白血病细胞THP-1分化作用研究

章成芳，马筱玲，戴春阳，孙晓曦

rLukS-PV体外诱导人急性髓系白血病细胞THP-1分化作用研究

章成芳，马筱玲，戴春阳，孙晓曦

目的研究金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞毒素亚组分（LukS-PV）对人急性髓系白血病细胞THP-1的诱导分化作用，为寻求白血病新的靶向治疗药物奠定基础方法分别采用0、0．50、1．00、1．50 μmol／L体外重组PV-杀白细胞毒素亚组分LukS-PV（rLukS-PV）体外刺激THP-1细胞24、48 h。倒置显微镜、瑞氏－吉萨姆染色镜检等方法观察rLukSPV作用前后细胞的形态学变化，流式细胞术检测细胞表面特异性抗原CD11b、CD14，荧光显微镜观察细胞吞噬功能结果经rLukS-PV刺激的THP-1细胞由分散、悬浮转变为黏附、贴壁，且呈梭形。细胞体积增大，胞质增多，核质比例缩小，细胞核呈肾形、三角形或不规则形，偏于一侧。细胞表面CD11b、CD14表达增加，以CD14增加较为显著，细胞对荧光颗粒吞噬功能明显增强。以上作用有明显的时间和剂量依赖性结论rLukS-PV具有诱导THP-1细胞向单核-巨噬细胞定向分化的作用，有望成为一种新的髓系白血病靶向治疗药物。

PV-杀白细胞毒素；THP-1细胞；诱导分化

诱导分化疗法是当前白血病治疗的主要方法之一。该方法与传统的化疗区别在于不杀伤肿瘤细胞，而是诱导其向正常或接近正常的细胞分化，同时逆转肿瘤细胞增殖、浸润、转移等恶性表型。全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）为研究较为广泛的分化诱导剂之一，在临床上用于诱导治疗急性早幼粒细胞白血病已取得了较高的完全缓解率［1］，但该药对其他亚型急性髓系白血病疗效不佳，且存在容易复发和产生耐药性的问题，所以寻找新的白血病治疗诱导剂是医学领域亟待解决的问题。LukS-PV是金黄色葡萄球菌分泌的PV-杀白细胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）两个组分之一。PV-杀白细胞素是一种细胞穿孔毒素，含有LukS-PV（33 ku）和LukF-PV（34 ku）两个组分，研究［2］表明，单组分rLukS-PV对靶细胞的毒性明显减低，但仍保留诱导靶细胞凋亡的活性。本实验组前期已研究证实rLukS-PV具有抑制THP-1细胞增殖诱导凋亡和细胞周期阻滞等作用［3］。但对于重组PV-杀白细胞毒素亚组分LukS-PV（recombinant LukS-PV，rLukS-PV）是否具有诱导THP-1细胞分化的作用未见研究报道。该实验以原单核白血病细胞株THP-1为模型，对rLukS-PV诱导白血病细胞分化作用进行研究。

1 材料与方法

1．1 材料白血病细胞株THP-1（中科院上海细胞研究所）；RPMI 1640培养基和新生胎牛血清（美国Gibco公司）；蛋白纯化试剂盒（德国Novagen公司）；FITC偶联的抗人CD11b单克隆抗体、PE偶联的抗人CD14单克隆抗体（美国eBioscience公司）；0．5 μm绿色荧光颗粒（美国Polysciences公司）；细胞培养瓶、6孔板（美国Corning公司）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；EPICS XL-2流式细胞仪（美国COULTER公司）；倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 将THP-1细胞培养于RPMI-1640培养基（含100 U／ml青霉素G、100 μg／ml链霉素和10%胎牛血清）培养，并置于5%CO2、37℃培养箱培养，每2～3 d传代1次。

1．2．2 rLukS-PV蛋白的表达与纯化及蛋白的定量

本课题组前期构建了重组表达载体pET28a-LukSPV，并转化入大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3），－80℃冻存。按常文娇等［4］实验方法进行rLukSPV蛋白表达和纯化。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作检测重组蛋白浓度。

1．2．3 rLukS-PV刺激THP-1细胞形态学观察 取对数生长期的THP-1细胞，将细胞浓度调整为5× 105～10×105／ml，分别加入0（对照组）、0．50、1．00、1．50 μmol／L rLukS-PV与细胞共培养。分别于培养24、48 h后，通过相差显微镜、瑞氏染色镜检等方法观察细胞形态改变。

1．2．4 细胞表面特异性抗原的检测 收集rLukSPV与THP-1细胞共培养24、48 h后细胞悬液，1 000 r／min离心5 min，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，加入5 μl FITC-CD11b和5 μl PE-CD14荧光抗体双标样品细胞，4℃避光孵育30 min，预冷PBS洗涤1次，200 μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行测定。

1．2．5 细胞吞噬功能的检测 根据Gaurnier-Hausser et al［5］实验方法，将0．5 μm的绿色荧光颗粒稀释浓度为5×1011／ml，向各组细胞中加入荧光颗粒，浓度为25 μl／ml培养液，37℃孵育2 h，收集细胞，冷PBS洗涤5次去除未吞噬荧光颗粒，荧光显微镜涂片观察细胞吞噬功能。

1．2．6 qRT-PCR检测信号通路基因表达 收集rLukS-PV与THP-1细胞共培养48 h后细胞悬液，收集细胞，抽提细胞RNA并逆转录为cDNA，根据abm EvaGreen 2X qPCR MasterMix实验方法，以β-actin作为内参，使用ABI7500PCR仪进行检测。

1．3 统计学处理采用SPSS 16．0软件进行统计分析，数据均以±s表示，多组数据之间比较采用方差分析。

2 结果

2．1 细胞形态学观察原单核白血病细胞THP-1正常情况下呈圆形，悬浮生长，经rLukS-PV作用后，部分THP-1细胞呈贴壁生长，且形状呈梭形。形态学上具有向巨噬细胞分化的特征。随着作用时间延长，48 h细胞贴壁生长程度及数量明显高于24 h；且随着rLukS-PV作用浓度的增加，细胞贴壁程度增加。rLukS-PV诱导THP-1细胞贴壁生长呈时间和剂量依赖性。见图1。rLukS-PV作用THP-1细胞后，细胞涂片进行瑞氏染色，光镜下观察细胞形态学发生明显变化。表现为细胞体积增大，胞质增多，核质比例缩小，核偏于一侧，细胞核呈肾形、三角形或不规则形。且随着作用时间和作用剂量增加，细胞分化增多，呈时间和剂量依赖性。见图2、3。

2．2 细胞表面抗原CD11b和CD14的表达流式细胞术检测rLukS-PV处理THP-1细胞后细胞表面抗原CD11b和CD14的表达，结果显示，rLukS-PV作用THP-1细胞24、48 h后，其表面抗原CD11b和CD14表达率均有增加，且CD14显著增加。见图4、5。作用48 h后，CD11b和CD14的表达均较24 h上调，呈时间依赖关系。在同一时间点，不同浓度rLukS-PV（0、0．50、1．00、1．50 μmol／L）实验组CD11b和CD14表达均随rLukS-PV浓度的增加而增加（F24＝36．53、F48＝26．57，P＜0．01；F24＝46．48、F48＝277．20，P＜0．01）。见图6结果提示rLukS-PV具有诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的潜能，且呈时间和剂量依赖性。

2．3 细胞吞噬功能的改变为进一步验证rLukSPV对THP-1细胞的诱导分化作用，荧光颗粒吞噬实验检测rLukS-PV刺激后的细胞吞噬功能结果显示经rLukS-PV作用后，THP-1细胞表现出对荧光颗粒的吞噬功能，且随着作用时间和作用剂量增加，细胞吞噬功能增强，呈时间和剂量依赖性。见图7。

2．4 MAPK信号通路基因的变化为研究rLukSPV诱导THP-1细胞分化的作用机制，qRT-PCR检测MAPK信号通路基因表达结果显示经rLukSPV刺激THP-1细胞48 h后，p38、JNK1、JNK2、ERK1、ERK2表达量均明显上调，且其下游转录调节因子Fos、Jun、c-myc、ATF2表达量也明显升高。见图8。

3 讨论

LukS-PV和LukF-PV同比例混合时，高浓度时可使细胞穿孔溶解（坏死），低浓度时则诱导细胞发生凋亡［6］。本课题前期成功构建了重组表达载体pET28a-LukS-PV，体外表达纯化重组蛋白LukSPV，研究［3］表明，rLukS-PV细胞毒性明显减低，且体外可以诱导人急性髓系白血病细胞THP-1凋亡及细胞周期阻滞，抑制其增殖，具有抗白血病细胞生长活性。

白血病发病的分子生物学机制与细胞增殖和细胞分化异常密切相关。诱导肿瘤细胞分化疗法是白血病治疗的新策略，该方法基本特点在于不杀伤肿瘤细胞，而是诱导其向正常或接近正常的细胞分化，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用［7］。本研究首次以人单核白血病细胞株THP-1为模型，通过观察细胞贴壁生长情况、细胞形态结构、表面抗原表达、吞噬功能等方法，研究rLukS-PV诱导THP-1细胞分化作用结果显示，rLukS-PV作用一段时间后，THP-1细胞部分呈梭形，有伪足，贴壁生长。瑞氏染色观察到rLukS-PV处理后THP-1细胞体积增大，胞质增多，核质比例减小，细胞核呈不规则形，位于一侧，表现出明显的巨噬细胞形态特征。

CD11b是细胞黏附分子整合蛋白家族成员之一MAC-1（CD11b／CD18）的α链，它主要在成熟单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞上表达，是单核／巨噬分化的标志。CD14为LPS受体，主要功能是结合LPS并引起细胞活化［8］，主要存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面，是单核／巨噬分化的主要标志。rLukS-PV刺激THP-1细胞后，细胞表面抗原CD14表达明显上调，且具有时间和剂量依赖性，在1．50 μmol／L rLukS-PV刺激THP-1细胞48 h后，CD14表达比例最高，可达24．3%。本研究中rLukS-PV诱导THP-1细胞分化表现出与PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化同样的表型改变，进一步证实了rLukS-PV诱导THP-1细胞分化向巨噬细胞分化方向。

巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，为验证THP-1细胞分化后功能的变化，检测了rLukS-PV作用后THP-1细胞对0．5 μm绿色荧光颗粒的吞噬作用，结果显示，经rLukS-PV诱导后，THP-1细胞表现出很强的荧光颗粒吞噬功能，且呈时间和剂量依赖关系。综合形态学、流式细胞术及吞噬实验结果，共同证实rLukS-PV体外诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化作用，并且诱导效率随时间和浓度的增加而增加，呈时间和剂量依赖关系。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程。在哺乳动物细胞中MAPK亚族主要包括ERK1／2、JNK、p38和ERK5，这几条通路之间存在相互“对话”从而导致通路间产生相互协同或抑制作用。研究［9］表明，维生素D3诱导白血病细胞HL60和U937粒系分化，主要作用机制是激活ERK1／2、JNK、p38信号通路并激活其下游转录因子如c-jun和ATF-2的磷酸化。在本研究中，THP-1细胞经rLukS-PV作用后，p38、JNK1／2、ERK1／2基因表达明显上调，且转录因子Fos、Jun、c-myc、ATF2表达增加。因此猜想，rLukS-PV有可能是通过激活ERK1／2、JNK、p38信号通路，进而激活其下游转录因子如Fos、Jun的磷酸化，从而达到诱导THP-1细胞分化的效果。

［1］ Nowak D，Stewart D，Koeffler H P．Differentiation therapy of leukemia：3 decades of development［J］．Blood，2009，113（16）：3655－65．

［2］ Löffler B，Hussain M，Grundmeier M，et al．Staphylococcus aureus panton-valentine leukocidin is a very potent cytotoxic factor for human neutrophils［J］．PLoS Pathog，2010，6（1）：e1000715．

［3］ Bu S，Xie Q，Chang W，et al．LukS-PV induces mitochondrial-mediated apoptosis and G0／G1cellcycle arrest in human acute myeloid leukemia THP-1cells［J］．Int J Biochem Cell Biol，2013，45（8）：1531－7．

［4］ 常文娇，马筱玲，沈继龙，等．金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞毒素的原核表达及生物学活性鉴定［J］．安徽医科大学学报，2011，34（1）：4－9．

［5］ Gaurnier-Hausser A，Rothman V L，Dimitrov S，et al．The novel angiogenic inhibitor，angiocidin，induces differentiation of monocytes to macrophages［J］．Cancer Res，2008，68（14）：5905－14．

［6］ Jayasinghe L，Bayley H．The leukocidin pore：evidence for an octamer with four LukF subunits and four LukS subunits alternating around a central axis［J］．Protein Sci，2005，14（10）：2550－61．

［7］ Silva G，Cardoso B A，Belo H，et al．Vorinostat induces apoptosis and differentiation in myeloid malignancies：genetic and molecular mechanisms［J］．PloS One，2013，8（1）：e53766．

［8］ Methe H，Kim J O，Kofler S，et al．Statins decrease Toll-like receptor 4 expression and downstream signaling in human CD14＋monocytes［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（7）：1439－45．

［9］ Wang Q，Wang X，Studzinski G P．Jun N-terminal kinase pathway enhances signaling of monocytic differentiation of human leukemia cells induced by 1，25-Dihydroxyvitamin D3［J］．J Cell Biochem，2003，89（6）：1087－101．

rLukS-PV induces differentiation function in human acute myeloid leukemia THP-1 cells in vitro

Zhang Chengfang，Ma Xiaoling，Dai Chunyang，et al
（Dept of Laboratory Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the induction differentiation effect of the subunit of Panton-Valentine leukocidin（LukS-PV）on the acute myeloid leukemia THP-1 cell lines and search a promising therapeutic strategy of myeloid leukemia．Methods THP-1 cells were treated with different concentrations（0，0．50，1．00，1．50 μmol／L）ofrecombinant LukS-PV（rLukS-PV）．After 24，48 h，the morphology of induced cells was observed with Wright-Giemsa staining under optical microscope．The expression of differentiation markers CD14 and CD11b was determined by flow cytometry．The cell phagocytosis of fluorescent particles was examined by fluorescence microscope．Results THP-1 cells treated with rLukS were changed from dispersal and suspended into adhesive and fusiform．Cell volume and cytoplasm content increased，nucleo-cytoplasmic ratio decreased．The shape of cell nucleus was reniform，triangle and irregular．The cell nucleus was located at the side of cells．The expression of CD11b and CD14 was significantly increased，especially CD14．The cell phagocytosis of fluorescent particles was also obviously enhanced．The above effects were both in a dose-and time-dependent manner．Conclusion rLukS-PV has the differentiation effect of inducing THP-1 cell lines into monocyte-macrophages system．These findings suggest the rLukS-PV maybe as a novel approach for treatment of myeloid leukemia．

rLukS-PV；THP-1 cell；induce differentiation

R 733．713

A

1000－1492（2015）03－0280－06

2014－11－23接收

安徽省自然科学基金（编号：1408085MH188）

安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥 230001

章成芳，女，硕士研究生；马筱玲，女，教授，研究生导师，责任作者，E-mail：xiaolingma＠126．com