SSR标记技术及其在杨梅上的应用

张绍阳，姚 永，罗 静，徐昌杰(．铜仁学院生物与农林工程学院梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州铜仁554300;2．浙江大学果实品质生物学实验室/浙江省园艺植物整合生物学研究与应用重点实验室，浙江杭州30058)

简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，又称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，是在生物基因组中由1～6个核苷酸组成的基本序列单元(或基序)多次重复串联构成的DNA序列，序列长度一般不超过200 bp［1］。SSR标记技术可用于果树种质资源遗传多样性、进化与分类、品种鉴定、同物异名和同名异物品种的鉴别、无性系和体细胞突变的鉴别、DNA指纹图谱构建、种质资源保存和利用以及分子遗传连锁图谱构建等研究，是目前果树遗传育种研究广泛应用的一种DNA分子标记技术［2-4］。

杨梅(2n=16)，又名朱红、树莓或龙晴，亚热带常绿乔木或灌木雌雄异株果树，为杨梅科(Myricaceae)杨梅属(Myrica L．)植物［5］;在我国，本属植物有 6 种和 5 个变种(变型)，栽培杨梅品种有305个，品系为120个，均属于杨梅(M．rubra)种［6-7］。杨梅是我国南方地区特色水果［7］，其果实于5月底～7月初成熟，成熟果实色泽鲜艳，柔嫩多汁，风味独特，果实含钾量高，具有较高的营养和医疗保健价值［8-10］。杨梅具有较高的栽培经济价值，现为浙江省第二大果树经济作物(仅次于柑橘)。

自2006年日本学者Terakawa等［11］报道杨梅SSR标记研究以来，近年来陆续有杨梅SSR标记相关研究的报道，这些研究很好地推进了杨梅种质资源研究工作。基于此，笔者先对SSR标记主要技术特性进行概述，再对SSR标记技术在杨梅上的应用进行综述，以期为相关研究提供参考。

1 SSR标记技术概述

1．1 SSR位点的类型及其特征 SSR位点广泛分布于植物基因组的不同位置，SSR位点不仅数量众多，而且也存在各种类型。在植物全基因组上，SSR位点数量可达104～105，广泛存在于基因组的各个区域，每隔10～50 kb就有1个SSR位点存在，SSR重复单位的碱基组成和重复次数因物种而异［2-3］。

依据重复单元(或基序)碱基个数不同，SSR可分为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸等重复类型。对于上述几种类型的SSR在全基因组上的构成，不同植物其构成也不尽相同。据报道，单核苷酸SSR在所有植物全基因组上数量最多(而且都是以A/T重复SSR为主)，五和六碱基核苷酸SSR明显少于其他类型的SSR;各种类型的SSR频率(即在全基因组上总体数量)随着重复次数增加而逐渐降低［12-14］。在葡萄和苹果上，二核苷酸SSR数量仅次于单核苷酸SSR，且AT/TA重复的SSR占该类型SSR总量的30%以上，三核苷酸SSR同单核苷酸SSR与二核苷酸SSR一起构成该类型植物基因组SSR的主体［12-13］;在拟南芥、水稻、大豆、玉米、高粱、苜蓿和杨树等植物上，单核苷酸至四核苷酸4种重复类型SSR占此几种植物全基因组SSR的绝大多数，其他类型SSR仅为总SSR的10%左右［14］。在葡萄上，SSR主要分布在基因间隔区，其次在基因的非翻译区，基因编码区SSR密度最小;三核苷酸SSR和六核苷酸SSR比其他SSR在编码区丰度要高，分别为19个/Mb和10个/Mb;数量丰富且易突变的二核苷酸SSR是开发SSR标记的重要来源［12］。

依据重复序列长度，Temnykh等［15］将SSR分为两类，第一类为ClassⅠSSR(高度可变类型)，其重复序列长度不低于20 bp;第二类为ClassⅡSSR(潜在可变类型)，其重复序列长度处于10～20 bp。依据核心序列排列方式不同，SSR可分为完全型、不完全型和复合型3种类型。完全型SSR的核心序列以不间断的重复方式首尾相连，目前研究的SSR大多属于此类;不完全型SSR的核心序列在非末端有不多于3个非重复碱基;复合型SSR，是指由2个或2个以上的核心序列串联组成的DNA片段，基本单元序列相同的2个核心序列之间要有不少于3个的非重复碱基［16］。后2种类型SSR在植物基因组中也占有一定比例，但目前此2种SSR标记研究很少。依据所在位点序列的来源，SSR也有3种类型:来源于各种基因组DNA序列的普通SSR(即genomic SSR)，来自于各基因编码区序列的EST-SSR(又可称为cDNA-SSR，cSSR或genic SSR)，以及来源自于细胞核外DNA序列的核外SSR(如叶绿体SSR和线粒体SSR等)。

1．2 SSR的遗传特性 起初，SSR序列被认为是一类垃圾DNA序列，不转录也不发挥生理调控功能。后来发现SSR在基因组上并不是随机分布的，一般基因间隔区DNA序列中SSR丰度比转录区高;在转录调控区、5'UTR(Untranslated regions，非翻译区)区、编码区和3'UTR区，SSR丰度呈依次下降趋势;SSR序列也有其特定的生物功能，如编码区SSR可导致蛋白质种类和功能改变，转录调控区SSR能影响基因转录效率，位于UTR的SSR位点长度可影响下游基因的翻译效率等［17-19］。不同生物种类SSR构成具有一定的特异性，SSR序列(包括基序种类和重复数大小)随着基因组位点不同而异，同一位点不同基因型生物个体SSR重复序列大小也可能有很大差异，SSR序列这种高度变异性就是SSR序列相关DNA标记技术产生DNA片段长度多态性的分子基础［20］。一般认为，单个SSR位点在不同基因型个体之间的多态性主要是由于DNA复制和修复过程中碱基滑动、错配或减数分裂过程中姐妹染色单体的不均等交换而造成［19，21-22］。

1．3 SSR标记技术原理及特点 SSR最初只是作为探针，用于真核生物基因组的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段长度多态性)研究。随着PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术建立，SSR广泛应用于DNA标记研究。基于SSR序列的多态性，即同一SSR位点在同种生物不同基因型的重复单元数有很大变化，产生了数种DNA标记技术，如SSR标记、ISSR(Inter-Simple Repeat Sequence，简单重复序列区间)标记［23］、RAMP(Random Amplified Microsatellite Polymorphisms，随机扩增微卫星多态性)标记［24］和 REMAP(Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphisms，逆转座子微卫星扩增多态性)标记［25］。

SSR标记技术是利用SSR序列比较保守的两翼序列设计成对引物组合进行PCR扩增，不同基因型样品的同一位点SSR-PCR产物则有可能会在凝胶(现多为聚丙烯酰胺凝胶)电泳上呈现长度的差异［26］。因SSR-PCR产物在凝胶电泳上呈现DNA片段长度的多态性，SSR标记又被称为SSLP(Simple Sequence Length Polymorphisms，简单序列重复长度多态性)标记。SSR标记具有数量多、分布广泛、呈共显性遗传和遗传信息丰富等特点。同时，SSR标记技术具有位点特异性、共显性、对DNA需要量少、对DNA质量要求不高、易于PCR检测、重复性好、操作简便以及适合高通量分析等特点［27］。PCR标记技术的重复性非常好，对于同一批SSR标记分析，不同工作人员其试验结果有很好的一致性［28］。

1．4 SSR标记开发 由于SSR标记是特异引物标记，必须先获取相关DNA序列，以找出相应SSR位点并依据其两翼序列设计成对PCR引物，才能进行SSR标记分析，所以SSR标记技术存在引物开发的问题［29］。以往获得SSR位点两侧序列或相应特异引物，通常采用以下途径:第一，利用SSR引物在近缘物种的通用性以及SSR引物具有很好的重复性能够在不同实验室共享等特性，搜集相关研究(主要包括有关文献)中所用的SSR引物;第二，查询相关生物信息公共数据库(如NCBI和EMBL等)，下载研究物种相关DNA序列，对其进行去冗余、去低质量序列和序列拼接处理，再采用软件(如Primer Premier 5．0或BatchPrimer 3等)设计引物;第三，构建相关DNA或cDNA文库，筛选SSR位点，然后根据两翼序列设计引物［30］。

除一些模式植物或主要作物外，通过前2条途径获得的植物SSR引物数量通常极其有限，难以满足遗传育种应用研究的需要，为此需要采用第3条途径开发SSR标记。关于采用此途径挖掘SSR位点或开发相应引物，目前报道有很多种策略［29，31-32］。然而，这些策略，其试验过程都非常复杂，而且还需要大量的测序，因此，通过此途径开发SSR引物费时费力，需要很高的试验费用。而且，即便采用此方法挖掘SSR位点，所获得SSR位点的数量也非常有限，使得SSR标记技术在植物研究中的更广泛应用受到了瓶颈性制约影响。

植物的一个全基因组或转录组上SSR位点十分丰富，其数量可达数万甚至几十万个［33］，这些SSR位点都是植物SSR标记应用研究所需要的宝贵资源。以前限于Sanger测序能力有限，从中开发出的SSR标记数量微乎其微。随着近些年来新一代测序(Next-Generation Sequencing，NGS)技术与生物信息学工具异军突起，通过全基因组测序或转录组测序便可以将一个植物的整个基因组或转录组上绝大部分SSR位点挖掘出来，这为绝大多数植物SSR标记大量开发提供了一种重要捷径［34-35］。

尽管植物基因组蕴含的SSR位点数量比转录组含有的SSR位点数量高出几倍甚至数十倍［33］，但基于转录组测序平台开发SSR标记的相关研究仍发展较快。究其原因，转录组测序技术已逐步取代基因芯片技术成为目前在全基因组水平上研究基因表达的主流方法。通过该技术，可以获得某一生物样品的低表达基因、不同样品间的表达差异、转录发生位点、转录本表达丰度以及SNP等重要结果［35-36］。进行SSR标记开发研究，也已逐渐成为植物转录组测序分析的一项重要内容。而且，从转录组测序获得的SSR都是ESTSSR，其序列都是转录本，因而这些SSR可能会与某些功能基因相关，开发出来的SSR标记有可能成为与某些生物表型性状相关的分子标记［37］。另外，虽然转录组EST-SSR多态性比基因组SSR低，但在近缘关系的植物之间可能有更好的通用性［38］。近年来，已有很多植物(包括杨梅)通过转录组测序技术开发了大量的 SSR标记［34，38-48］，与基于新一代测序技术开展的全基因组 SSR标记研究，如在杨梅［49-50］、可可［51］、玉米［52］、芝麻［53］、枣［54］、白菜［55］等植物上，相得益彰。

2 杨梅SSR标记研究概况

2．1 国外研究概况 杨梅是我国特色栽培果树，其在国外分布很少，关于杨梅SSR标记研究也仅有2篇报道。2006年，Terakawa等［11］从富集CT重复序列的杨梅基因组文库克隆文库中开发出了13个SSR标记，并对32个杨梅样品进行了标记鉴别和遗传多样性分析。2009年，Terabawa等［56］又利用其中10个SSR标记，分析所研究区域福岛猕猴粪便所含杨梅种子的遗传多样性，发现福岛猕猴散播种子在杨梅种群遗传多样性的形成和维持中起着重要作用。

2．2 国内研究概况 国内学者对杨梅SSR标记研究已有8篇(有7篇为外文)，除其中1篇(Xie等［57］)作者所在单位为浙江省农业科学院园艺研究所外，其他7篇均由浙江大学果树科学研究所的研究者发表。

2009年，Zhang等［58］从‘荸荠’杨梅不同组织 EST文库克隆片段序列和克隆的MYB相关基因cDNA序列中分别获得了9个和2个SSR位点，并用保存在浙江省余姚市的中国杨梅资源圃［7］中的32个杨梅品种分析了各个SSR位点的多态性特征。2011年，Xie等［59］利用已研究的14个 SSR标记［11，58］，采用荧光SSR标记技术，对保存在上述杨梅资源圃内的122个杨梅样品(主要来源于我国7个省)和1个蜡杨梅(M．cerifera)样品进行了遗传聚类分析，将其分为几个类别，并发现同一地理区域的样品遗传差异相对较小;又用其中的10个SSR标记构建了52个主要样品的DNA指纹图谱;发现杨梅的SSR引物可以通用于蜡杨梅相关研究。Xie等［57］以G(G/C)G(GT)6作为富集SSR序列的引物，利用ISSR抑制PCR法，从‘黑晶’杨梅基因组DNA中获得了完全型和复合型SSR位点各6对引物，并用24个杨梅和2个矮杨梅(M．nana)作为样品进行筛选，从中开发出了9个SSR标记，该研究为杨梅或其他一些植物SSR标记开发提供了一种策略或思路。

2012 年，Jiao等［49］采用Illumina Hi-Seq 2000 测序平台对用杨梅株系‘C1020-55’所构建250和500 bp的基因组文库进行高通测序，产生了9．01 Gb序列数据(杨梅基因组323 Mb的26倍覆盖度)，应用 MISA(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa/misa．html)从初步拼接的各 scaffold序列片段(总大小为255 Mb)中鉴别出28，602个SSR位点(不含单核苷酸和非完全型SSR位点)，发现二核苷酸SSR数量最大(占总量的 84．73%)，用 BatchPrimer3 软件(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa)设计引物，从中选取600对引物，并用29个杨梅和3个杨梅属其他植物样品进行多态性标记筛选出158个SSR标记(每个SSR位点平均可产生8．25个等位条带，多态性信息含量平均为0．67)，并对所获得SSR标记在杨梅属植物间的通用性进行了分析。基于Feng等［60］的‘荸荠’杨梅Illumina Hi-Seq 2000转录组测序数据，通过重头拼接所获得41 239条 Unigenes序列(总大小为20．9 Mb，平均大小为539 bp)，Zhang等［43］利用MISA软件鉴别ESTSSR位点，发现6883个EST-SSR位点位于5 472条Unigenes上(出现频率为每3．2 Kb含1个 EST-SSR位点)，每个位点序列长度为10～48 bp，二核苷酸和三核苷酸EST-SSR位点所占比例超过总量的75%，有1326个EST-SSR位点包含在594个复合EST-SSR序列中，其他5557个位点则为完全型ESR-SSR;从6 151个EST-SSR中，选取412个用于设计SSR引物，成功设计267对引物，并用10个杨梅主要品种(系)，筛选出109个EST-SSR标记(产生了389个等位片段，多态性比率为 93．8%)。

2014 年，Jia等［50］基于 Jiao等［49］高通测序结果又开发出了107个SSR标记。至此，杨梅研究可用的SSR标记(包括EST-SSR标记)由2012年前的36个上升至410个，为杨梅种质资源SSR标记研究奠定了良好基础。在上述研究中，Jia等［50］用所获得全部SSR标记对45个杨梅样品进行遗传关系分析，确认了研究小组前期研究结论，使得各主要杨梅品种(品系)遗传关系更为明确;优系‘Y2010-70’、‘Y2012-140’及‘Y2012-145’也被从基因型上确定为新品系。汪国云等［61］基于 Xie等［57］构建的杨梅品种鉴别指纹图谱结果，选用相同的引物，对9个杨梅品种，基于遗传测序仪高效和自动化特性，构建了多重荧光SSR标记鉴别DNA指纹图谱，为相应果实质量检测及优良品系选择提供了很大便利。

2015 年，基于前期研究［43］，Zhang 等［62］对杨梅 11 个类型EST-SSR的多态性(包括多态性比率和单个位点多态性水平)比较研究，发现不同类型EST-SSR多态性差异十分显著，研究结果对于杨梅和其他果树转录组(或基因组)多态性SSR标记的高效率筛选具有较好的参考作用。

3 总结与展望

SSR标记技术具有其他DNA标记技术无可比拟的优势，新一代测序技术能够大大推动许多植物SSR标记的大量开发，SSR标记技术也将得到更为广泛的应用。作为我国特色的果树种质资源，近年来，国内对杨梅SSR标记研究已取得长足进展，开发了众多的SSR标记，并在一定程度明确了许多重要杨梅品系的亲缘关系，为后续更多的杨梅种质资源SSR标记研究奠定了良好基础。

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