小麦SSR标记在垂穗披碱草中的通用性分析

陈仕勇，陈智华，马 啸，张新全，朱永群，李世丹

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川农业大学草业科学系，四川 成都 611130；3.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

小麦SSR标记在垂穗披碱草中的通用性分析

陈仕勇1，陈智华1，马 啸2，张新全2，朱永群3，李世丹1

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川农业大学草业科学系，四川 成都 611130；3.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

分析评价了小麦SSR引物在高寒牧草垂穗披碱草Elymusnutans中的通用性.试验选用了58对小麦SSR引物，其中30对引物能扩增出条带，14对能产生多态性较好的条带，占选用引物的24.1%.通过比较分析其扩增位点数及多态性信息含量等得出WMS518、WMS44、WMS72、WMS219等引物具有较高的标记效率.本研究结果为垂穗披碱草SSR标记的开发、遗传变异分析等提供了可靠的参考依据.

小麦SSR标记；垂穗披碱草；通用性；引物开发

垂穗披碱草(Elymus nutans Griseb.)又名钩头草，是禾本科披碱草属一种重要的多年生牧草，广泛分布于我国的西北、西南、华北等地，特别在青藏高原高寒地区分布有丰富的垂穗披碱草种质资源[1].该物种不仅是一种具有优良饲用价值的牧草资源，还是高寒地区草原植被等的重要组成物种，具有非常重要的生态和经济价值[2].目前，垂穗披碱草已经成为青藏高原牧区人工种草、草地改良等的当家草种之一，在高寒牧区生态建设和草原畜牧业发展中发挥了重要的作用[2].

简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)标记是目前种质资源研究中最常用的分子标记之一，具有标记位点多，多态性高，共显性以及稳定性和重复性好等特点，在植物遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种等方面已经广泛运用[3-5].虽然SSR标记具有较多优点，但是其引物具有种属的专一性，而其专用引物开发成本较高，相对限制了SSR标记在不同物种中的进一步应用.在SSR标记的研究中发现SSR重复序列两端的侧翼序列在近缘物种中具有高度的保守性，这为把已开发的SSR标记转移到近缘物种中提供了可能[6].

目前小麦SSR标记已经成功地转移到小麦族近缘物种当中，如偃麦草属[7]、冰草属[8]、披碱草属等[9]，筛选出了能在近缘种属中清晰扩增的小麦SSR标记，并在其遗传评价及亲缘关系分析中发挥了重要作用.另外，目前报道的小麦族SSR标记的通用性研究主要在一些属的水平上，在具体的某个物种上的通用性研究还相对较少.虽然小麦SSR标记在披碱草属中也得到了较多的应用，但在垂穗披碱草种质资源研究方面的应用还相对较少[9-10].本研究采用小麦的SSR引物对垂穗披碱草进行分析，评价小麦SSR引物在垂穗披碱草遗传分析中的通用性，以期为垂穗披碱草SSR标记的开发、物种的遗传分析等提供理论依据和参考.

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为2007年收集自四川、西藏、青海、甘肃及新疆等地区的63份野生垂穗披碱草材料(表1)，供试材料详细资料见前期SRAP标记分析中[11].

表1 材料列表Table1 List ofmaterials used in the study

23 Y2196 西藏左贡24 205221 四川阿坝25 205229 四川阿坝26 Y2227 四川巴塘27 205120 四川稻城28 205116 四川稻城29 205089 四川稻城30 205096 四川稻城31 Y2120 四川德格32 Y2122 四川德格33 Y2126 四川德格34 PI 619569 四川德格35 Y2155 四川甘孜36 205097 四川红原37 PI 619520 四川红原38 PI 639862 四川康定39 W6 22107 四川康定40 Y2081 四川康定41 Y2084 四川康定42 205106 四川理塘43 205143 四川理塘44 Y2110 四川炉霍45 PI 619521 四川炉霍46 Y2095 四川乾宁47 Y2097 四川乾宁48 205218 四川壤塘49 PI 619519 新疆布尔津50 Y1608 新疆富蕴51 Y1611 新疆富蕴52 Y1558 新疆富蕴53 Y619575 新疆哈巴河54 Y0497 新疆和静55 PI 619576 新疆喀什56 PI 619578 新疆喀什57 Y0672 新疆58 Y0685 新疆59 Y0605 新疆叶城60 Y0627 新疆叶城61 Y0639 新疆叶城62 Y0655 新疆叶城63 Y0618 新疆叶城

1.2 小麦SSR引物筛选及SSR分析

供试材料每份随机选取10株植株的幼嫩叶片混合采用CTAB法提取DNA[12].小麦SSR的PCR反应体系及扩增程序参照Röder等进行[13].根据已发表的小麦SSR标记以及在披碱草属物种中的应用情况，试验选用了其中58对引物对垂穗披碱草进行SSR分析[13].PCR反应在PTC-200扩增仪上进行，不同引物的退火温度及预期扩增片段大小详见表2.扩增产物95℃变性后在6%聚丙烯酰胺凝胶中分离，恒压400V电泳1.5 h，电泳结束后银染并用数码相机拍照

保存.

1.3 数据分析

电泳图谱条带统计按照有带记为1，无带记为0组成数据矩阵.统计每对引物的总位点数(Total number of bands，TNB)、多态性位点数(Number of polymorphic bands，NPB)、多态性位点比率(Percentage of polymorphic bands，PPB)、多态性信息含量指数(Polymorphic informative content，PIC)[14]、标记指数(Marker index，MI)[15]，其中PIC i＝2fi(1-fi)，其中fi为扩增条带的频率，MI＝PIC×NPB.

2 结果和分析

2.1 引物筛选

试验筛选了58对小麦引物对供试材料进行SSR扩增，其中具有32对能扩增出条带，占选用引物的55.2%；筛选出其中多态性较好的引物14对，占所用引物的24.1%，所筛选引物的43.8%.在筛选出的14对引物中，其中8对引物来自小麦的B基因组连锁群，4对引物来自D基因组连锁群，只有2对引物来自A基因组连锁群.这也表明垂穗披碱草与小麦的B基因组可能具有相对较多的同源序列，可以为下一步相关SSR标记的选择提供参考(如表2所示).

表2 试验选用小麦SSR引物及序列信息Table2 The sequence information ofwheat SSR primers used in the study

2.2 引物效用分析

筛选出的多态性SSR引物的扩增位点数变化为3(WMS 5)～14(WMS 271，WMSTaglut)，其中多态性位点变化为1(WMS 5)～14(WMS 271，WMS Taglut).引物的PIC值变化为0.099(WMS 268)～ 0.447(WMS 518).其中引物 WMS 44、WMS 518、WMS72、WMS 295、WMS 219的多态性位点及PIC和MI值都较高，体现出较高的标记效率，其中WMS 295是其中标记效率最高的标记，这些都是垂穗披碱草SSR标记的高效用引物(表3，图1、图2).

表3 试验选用小麦SSR引物及扩增情况Table3 The wheat SSR primers and amplification results in the study

图1 小麦SSR引物WMS518(1-45号，从左到右顺序)的扩增电泳图Fig.1 The amplification results of wheat SSR primerWMS 518(No.1-45)

图2 小麦SSR引物WMS44(1-40号，从左到右顺序)的扩增电泳图Fig.2 The amplification results ofwheat SSR primerWMS 44(No.1-44)

3 讨论

基因组SSR分子标记及基于EST数据库的EST -SSR标记的开发都依赖于相关物种基因组文库及测序等研究深度，这限制了一些物种SSR相关分子标记的开发和运用.SSR标记在近缘物种的转移成为了一种简单获取标记的方法，目前在小麦、棉花、大豆等作物的SSR标记已经成功转移到相关的近缘物种中[16-17].洪彦彬等[17]分析了源于大豆EST-SSR标记在花生属中的转移性，结果表明了通过大豆ESTSSR开发花生属同源SSR标记的可行性.Saha等[18]评价了来自高羊茅的EST-SSR标记在几种禾草SSR分析中的通用性，结果发现这些标记在羊茅属和黑麦草属中具有重要的应用价值.这些研究都表明了利用SSR标记在近缘物种中的通用性是进行SSR分析的一种简单可靠的方法，也进一步表明了本研究方法的可行性.

小麦族包括约30个属500个物种，仅有少部分种属开发了专用SSR标记.其中小麦、大麦等麦类作物的SSR标记开发相对成熟和丰富，为其他小麦族物种的SSR标记的开发提供了可能，特别对于小麦族多年生牧草资源提供了参考.MacRitchie和Sun[19]研究发现供试的52%的大麦和68%的小麦SSR引物能够在小麦族近缘物种披碱草属Elymus trachycaulus和拟鹅观草属Pseudoroegneria spicata中扩增出产物.严学兵等[10]选用了8对小麦SSR和14对披碱草属SSR引物对我国的披碱草植物进行分析，结果表明来自披碱草的6对(43%)和小麦的5对(63%)引物能够扩增出稳定可靠的结果.车永和等[8]也对小麦的SSR标记在冰草属物种中的通用性进行了分析，约42%的引物能够扩增出条带，进一步筛选出了42对多态性较高小麦SSR引物.本研究中筛选的小麦SSR中55.2%的能够扩增出条带，24.1%的标记能够获得较高的多态性并进一步利用，所以小麦SSR在披碱草属垂穗披碱草中的通用性分析也得到了相似的研究结果.这些都表明了小麦SSR标记在小麦族物种中具有一定的通用性.同时，本研究结果将为小麦SSR标记在垂穗披碱草的遗传多样性分析、连锁图谱构建及QTL定位等提供参考依据.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Analysis on transferability of wheat SSR markers in Elymus nutans Griseb.

CHEN Shi-yong1，CHEN Zhi-hua1，M A Xiao2，ZHANG Xin-quan2，ZHU Yong-qun3，LIShi-dan1

((1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；
2.Department of Grassland Science，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，P.R.C.；
3.Soil and Fertilizer Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，P.R.C.))

The transferability of wheat SSR markers in Elymusnutans was assessed in this study.A total of58 primerswere selected for amplification，ofwhich 30 primers could generate bands and 14 primers could yield polymorphic bandswith a ratio of 24.1%.Then，primers including WMS518，WMS44，WMS72 and WMS219，were evaluated for high mark efficiency based on polymorphic bands，PIC and MI.The results could supply useful information for the SSR application and genetic analysis in E. nutans.

wheat SSRmarker；Elymus nutans；transferability；primer development

S54；S813

A

2095-4271(2015)03-0265-05

10.11920/xnmdzk.2015.03.001

2015-04-01

陈仕勇(1984-)，男，汉族，四川三台人，讲师，博士，研究方向:牧草种质资源创新及育种.

西南民族大学中央高校基本科研业务费专项基金项目(2014NZYQN41)