木霉菌剂与重茬净复配防治平贝黑腐病及对平贝诱导抗性

宋小双，遇文婧，周 琦，邓 勋

(黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨150040)

随着黑龙江省森工全面停止商业性采伐和经营模式转型，林下经济已经成为森工林业经济中的重要增长点［1］。北药栽培是森工林下经济的重要板块，其中平贝栽培是部分林业局的支柱产业之一。平贝系百合科多年生草本植物平贝母(Fritillaria ussuriensis)干燥的鳞茎，性味平苦，具有清热解毒、润肺止咳化痰的功效［2］。

黑腐病是平贝最重要的病害，又名菌核病，属于土传病害，以土壤为媒介进行传播，严重可导致平贝绝产［3-4］，目前黑腐病主要以化学防治为主，但效果不理想，多年的化学防治导致病原菌抗药性增加，土壤退化，重茬障碍问题发生严重。随着药用植物栽培的规范化，生物防治技术日益受到重视［5-9］，通过人为引进植物根际有益微生物(包括生防菌)与土壤生物改良剂，在有效控制病害发生的同时，促进植物生长、增强抗逆性，并达到改良土壤理化结构和微生态系统的目的。对于药用植物包括人参、西洋参、田七等的土传病害生物防治及其生态控制研究的均有深入研究，包括连坐障碍发生机制［10-14］、拮抗菌株的分离筛选［15-19］、生防作用机理［20］、菌剂田间应用［21-22］等，而平贝土传病害研究较少，本研究在分离鉴定平贝黑腐病致病菌基础上，采用生物防治和土壤改良技术相结合，对平贝黑腐病的生态控制进行探讨。

1 材料与方法

1．1 试验材料

(1)试验用菌株。绿木霉(Trichoderma virens)T43为从以色列引进高效菌株，对多种植物病害均有高效的防治效果［23-30］，保存于东北林业大学森林微生物实验室。平贝黑腐病病原菌核盘菌PB-06(Sclerotinia sclerotiorum):分离自黑龙江省牡丹江市海林林业局三十五林场平贝栽培基地，保存于黑龙江省森林保护研究所。

(2)土壤改良剂。重茬净复合生物菌肥购自武汉金禾生物科技公司;土壤消毒剂:敌克松(敌磺钠)购自山东天威农药有限公司。

1．2 绿木霉T43及其发酵液对平贝黑腐病菌的抑制作用

(1)拮抗作用。采用平板对峙培养法［31］，在接种培养黑腐病菌5 d后，接种木霉菌T43，48 h后测量菌落半径，计算抑制率，并对对峙拮抗线进行观察和描述，每个处理3次重复。

抑制率= ［(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径］ ×100%。

(2)发酵液抑菌实验。采用菌丝生长抑制法［32］，参考邓勋［29］方法制备非挥发性代谢产物后添加到PDA培养基中，使终浓度达到20%，以不添加代谢产物的PDA平板作对照，25℃恒温培养7d，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算木霉代谢产物对病原菌生长的抑制率，每个处理3次重复。

抑制率= ［(对照菌落半径-抑制培养菌落半径)/对照菌落半径］ ×100%。

1．3 平贝黑腐病生物-化学防治实验设计

(1)防治地点及概况。位于牡丹江市海林林业局三十五林场平贝栽培基地，平贝种植面积124 hm2，平贝栽培始于1980年，为多年连作栽培模式，林场年有效积温2 400℃。全年日照时数2 540 h。年平均降水量550 mm。无霜期125 d左右，近年平贝黑腐病、灰霉病发生严重，发病率50%以上。

(2)防治时间:2013年6月。

(3)防治实验设计。使用药剂包括生防菌绿木霉、土壤改良剂重茬净、土壤消毒剂敌克松不同组合，试验设计如下:①绿木霉;②重茬净;③敌克松;④绿木霉+重茬净;⑤绿木霉+重茬净+敌克松;⑥对照，每处理面积50 m2，在6月份平贝采收栽培同时，采用拌土的方式施用药剂。

1．4 调查指标及统计分析

(1)防治效果调查。2014年5月份进行防治效果调查，在不同防治处理区分别取样，调查平贝地下鳞茎黑腐病发病情况，统计发病鳞茎和健康鳞茎数量，计算发病率和防治效果。

相对防治效果(%)= ［(对照发病率-处理发病率)/对照发病率］ ×100%。

(2)不同处理对平贝根际微生物群落的影响。分别在2013年7月和2014年5月两次采集平贝根际土样，采用平板计数法［33］统计平贝根际真菌、细菌和放线菌数量，评价不同处理对土壤微生物群落的影响和土壤改良作用。

(3)对主要生理指标的影响。2014年5月采集平贝样品，测定生理指标。

可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G250法测定［34］。

叶绿素与类胡萝卜素含量测定采用丙酮-乙醇混合液法测定［35］。

抗氧化酶(SOD酶、POD酶、CAT酶)活性采用南京建成生物工程公司的抗氧化检测试剂盒利用光度计法进行酶活测定［36］。

2 结果与分析

2．1 木霉菌对平贝黑腐病菌的离体测试

对峙培养结果表明绿木霉T43对平贝黑腐病菌PB-06有较好的拮抗作用，对病原菌的抑制率为60．23%，对峙培养后期，绿木霉菌落完全覆盖病原菌菌落，体现了极强的竞争作用。同时绿木霉发酵液提取物也可以明显抑制平贝黑腐病菌PB06的菌丝生长，抑制率为62．58%，病原菌菌落生长缓慢，菌丝稀疏，气生菌丝较多。

2．2 平贝黑腐病生物-化学防治

为有效控制平贝黑腐病，本次实验设计采用了生防菌剂(木霉菌剂)、土壤改良剂(重茬净)和土壤消毒剂(敌克松)分别对平贝黑腐病进行了防治研究，通过调查植株发病率，结果表明木霉菌结合土壤改良剂重茬净可有效控制平贝黑腐病的发生(见表1)。不同处理之间差异显著(P＜0．05)，由于多年连作，平贝黑腐病菌对化学杀菌剂形成了较强的抗性，单独使用敌克松后，对病害的相对防治效果只有36．01%，而绿木霉+重茬净效果最好，相对防治效果达到69．24%，其次是绿木霉+重茬净+敌克松，相对防治效果为64．58%。目前的统计结果是防治第一年的效果，而平贝从栽培到采收，要连续在土壤中存留2 a周期，因此，防治效果的持续性，需要到下一点继续调查。

表1 平贝黑腐病的生物-化学防治效果Tab．1 Bio-chemical control effect on F．ussuriensis black rot

2．3 对平贝根际微生物群落的影响

通过生物—化学防治技术可有效控制平贝黑腐病的发生，通过统计防治前后平贝根际微生物群落的数量变化，可以间接反映对平贝连作土的改良和修复作用(见表2)，我们对平贝健康和受害植物根际的微生物群落也进行了统计分析(数据未在此展示)，以阐明其发病机理，研究结果表明，连作年份越长，其微生物生态系统越趋向于单一，同时真菌数量明显高于正常数量，而细菌数量与不连作土壤相比，更加丰富。而通过生物-化学防治技术在有效控制平贝黑腐病发生的同时，对连作土的生物修复作用也起到了明显的效果，同防治前相比，除单独使用敌克松外，绿木霉、重茬净、绿木霉+重茬净以及绿木霉+重茬净+敌克松的组合均提高了土壤中细菌和防线菌的数量，丰富了微生物种群，而木霉菌处理组合中，真菌数量的增加，通过平板培养证明是木霉菌在土壤中有效定殖，提高了土壤中真菌的数量。

2．4 对平贝主要生理指标的影响

木霉菌T43对植物具有促生抗逆作用，而土壤改良剂重茬净主要生物成份为生防细菌和放线菌，在有效控制病害发生的同时，对土壤改良和修复也起到了重要作用。2种生物菌剂在使用后，对平贝的主要生理指标包括可溶性蛋白含量和叶绿素含量均有提高作用(见表3)。其中绿木霉+重茬净组合同对照相比，平贝可溶性蛋白含量提高30%左右，大大增加了平贝的干物质含量，在后续研究中，通过测定平贝主要活性成分含量的变化对生物菌剂施用的响应作用，可以进一步说明生物制剂对平贝植株生长的影响。平贝植株保护酶包括SOD、CAT和POD在施用生物菌剂后均有一定程度的提高(见表4)，提高幅度在10% ～20%之间，说明平贝植株的抗逆性提高，对黑腐病的发生也起到一定的抑制作用。

表2 生物-化学防治技术对平贝根际微生物群落的影响Tab．2 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis rhizosphere microbial community

表3 生物-化学防治技术对平贝叶片主要生理指标的影响Tab．3 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis leaf physiological index

表4 生物-化学防治技术对平贝植株保护酶活性的影响Tab．4 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis protective enzyme activity

3 结论与讨论

(1)采用生防菌剂(木霉菌)+土壤改良剂(重茬净)+土壤消毒剂(敌克松)的不同组合对平贝黑腐病的田间防治进行研究，结果表明木霉菌+重茬净组合可有效控制病害发生，对平贝黑腐病的相对防治效果达到69．94%。

(2)生物菌剂的使用可有效改良平贝连作土中微生物群落结构，改变病原菌占主导地位的格局，增加细菌和放线菌生物量，使土壤微生态系统保持稳定。

将不同生防菌和土壤微生物改良剂复配，发挥各自的优势和协同作用，可以降低植物病害的发病率，增强防治效果［37］。木霉菌T43对多种植物病害均有高效的防治效果［23-30］，竞争优势在于产孢量大、易于扩大生存空间，同时代谢抑菌活性成分。重茬净含有多种益生细菌，具有改良土壤的作用。本研究将木霉与重茬净复配施用，对平贝黑腐病进行防治，相对防效可达69．94%，能够实现不同生防机制同时起作用，避免了单一生防菌应用导致的病原微生物抗性的产生。多种生防菌复配使用是解决土传病害和重茬障碍的有效途径，张爱华用2种生防细菌复配对西洋参锈腐病的盆栽和田间相对防效分别达到88．93%和44．57%，可有效控制病害的发生［21］。长柄木霉和泾阳链霉菌两种生防菌复配，对烟草黑胫病的相对防治效果达到了69．3%［38］。木霉菌与土壤改良剂的复配使用对平贝的增产机制有待于进一步研究。

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