阿司匹林对结肠癌细胞肿瘤干性标记物CD44蛋白表达的影响

鲁生念，廖永美，赵逵

（遵义医学院，贵州遵义563099）

阿司匹林对结肠癌细胞肿瘤干性标记物CD44蛋白表达的影响

鲁生念，廖永美，赵逵

（遵义医学院，贵州遵义563099）

目的研究人结肠癌细胞系SW-480、HT-29中肿瘤干细胞干性标记物CD44蛋白受阿司匹林不同药物浓度的影响变化，从而探讨阿司匹林是如何预防结直肠癌的发生。方法采用激光扫描共聚焦显微技术：免疫荧光双标染色法检测结肠癌细胞系SW-480、HT-29中CD44的表达；用Western blotting检测不同浓度阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L，即分别为空白对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组）作用下，CD44在COX-2阴性表达的SW-480细胞及COX-2高表达的HT-29细胞表达影响。结果SW-480、HT-29中存在CD44阳性细胞，2种细胞表达的CD44荧光值比较，差异有统计学意义（P<0.05）；Western blotting结果显示阿司匹林能抑制结肠癌细胞系SW-480、HT-29中CD44的表达，且具有明显的量-效关系（P<0.05），2种细胞组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论结肠癌细胞系SW-480、HT-29中存在CD44阳性细胞，阿司匹林能抑制肿瘤干细胞干性标记物CD44的表达，其抑制可能是通过COX-2及非COX-2途径，该抑制作用可能是阿司匹林能预防结肠癌的原因之一。

阿司匹林；结肠肿瘤；肿瘤干细胞；CD44蛋白

结直肠癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在西方发达国家已经居于恶性肿瘤第3位[1]。我国近年来由于环境、饮食及生活习惯等因素的改变，结直肠癌的发病率以及患者死亡率呈明显上升趋势，如何有效地进行预防及改进治疗方法成为目前亟待解决的问题。直至肿瘤干细胞（CSCs）概念[2-3]的提出为肿瘤研究提供了新的方向及思路，是目前放疗、化疗及生物免疫治疗等方法能够杀灭部分肿瘤细胞的“靶标”，使更有效地治疗恶性肿瘤成为可能。

CD44是一种由单基因编码，具有一个高度保守的N末端的一种跨膜糖蛋白，其基因位于11p13。有研究认为，CD44具有GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸连接蛋白，具有独特的信号传递通路，是一种重要的细胞黏附因子。CD44分布广泛，它对多种肿瘤的发生发展、侵袭、转移及临床预后都至关重要[4]。阿司匹林作为一种临床常用的非甾体抗炎药（NSAIDs），除常用于解热、镇痛、抗炎等外，常用于预防某些恶性肿瘤的发生发展，例如每天服用该类药物能降低结直肠腺瘤及癌症发生的风险，能抑制甚至逆转结直肠癌的癌前病变[5-6]，有效地改善患者预后。有大量研究认为，阿司匹林是通过依赖COX-2途径发挥抗肿瘤作用，但针对某些肿瘤并未表达COX-2，NSAIDs仍能抑制肿瘤的发生。阿司匹林是如何作用于结直肠癌细胞，对CSCs干性标志物CD44产生的影响尚不清楚，本实验拟通过研究不同浓度阿司匹林对人结肠癌细胞系SW-480、HT-29中CD44蛋白表达的影响以探讨其对结直肠癌的潜在影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人结肠癌细胞株SW-480、HT-29分别购买于重庆医科大学细胞实验室及中国科学研究院上海细胞库。

1.1.2 药物和主要试剂阿司匹林、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸（EDTA）购于美国Sigma公司，1640培养基及胎牛血清购于美国Hyclone公司，小鼠抗人CD44单克隆抗体购于美国Cell Signling Technology公司，小鼠抗人β-actin辣根酶标记山羊抗兔IgG及辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养用含10%胎牛血清及1%双抗的1640培养基培养人结肠癌细胞株SW-480、HT-29，孵箱的条件设置为37℃、5%CO2，培养瓶为25 cm2，细胞贴壁生长，当生长状态良好并融合至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA混合液消化、离心（1000 r/min，5 min），进行传代培养，将处于对数生长期、状态优良的细胞收集用于实验。

1.2.2 免疫荧光双标法检测SW-480和HT-29细胞中CD44的表达将高压后的无菌盖玻片置于6孔板中，进行细胞种板，种板时调整每孔细胞密度为0.8×105mL-1，继续培养过夜，贴壁后4%多聚甲醛进行固定，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，用0.5%Triton-X-100的PBS通透化15 min，1%牛血清蛋白（BSA）封闭；加入按抗体说明书进行1∶400稀释的鼠抗人CD44单克隆抗体，室温避光孵育1 h后4℃过夜，弃去抗体稀释液后，PBS反复漂洗，加四乙基若丹明异硫氰酸盐（TRITC）标记的1∶100稀释的二抗，避光孵育1 h，漂洗后捞片、风干、封固，同时PBS代替一抗用于阴性对照组实验，共聚焦显微镜下观察并采集图片，采图时每张细胞玻片上选取3个比较具有代表性的区域，按照标准选择参数拍照。

1.2.3 Western blotting法检测结肠癌细胞系SW-480、HT-29细胞中CD44蛋白的表达将生长状态良好、处于对数生长期的2种细胞分别进行消化离心，吹打为单细胞悬液，调整密度为5×105mL-1后于25 cm2的培养瓶中继续培养。配置含有阿司匹林的完全培养基，空白对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组药物浓度分别为0、2.5、5.0、10.0 mmol/L。细胞贴壁生长24 h后分别加入上述不同组别的培养基再培养24 h后收集细胞用于实验。裂解液（RIPA）提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，定浓度为80 μg/μL，10%的聚丙烯酰胺凝胶上量20 μL（每孔约30 μg）进行电泳，恒压转膜（40 mV，4 h）后，予5%脱脂蛋白封闭1h，0.1%洗膜缓冲液（TBST）洗3次后加入1∶1 000稀释的小鼠抗人CD44单克隆抗体以及1∶5 000稀释的小鼠抗人β-actin一抗，摇床上4℃过夜，TBST漂洗，加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG室温下孵育1 h，TBST再次漂洗，应用鲁米诺荧光显色，暗室内胶片曝光，根据胶片上显影效果，调整曝光时间直至出现最佳条带，电脑扫描，结果用凝胶图像分析系统进行分析。

1.3 统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 激光共聚焦免疫荧光双标结果

2.1.1 免疫荧光分析CD44在结肠癌细胞系SW-480、HT-29细胞中的表达见图1。

图1 免疫荧光法分析CD44在SW-280、HT-29中的表达（×200）

2.1.2 免疫荧光双标法检测CD44在SW-480、HT-29细胞中表达的荧光值分别104.110±3.123、83.771±3.999，其在这2种结肠癌细胞中的表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 结肠癌细胞系SW-480、HT-29细胞中CD44荧光值比较

2.2 Western blotting法分析不同组别阿司匹林对结肠癌细胞系SW-480、HT-29细胞中CD44蛋白表达的影响Western blotting法检测结果显示，在SW-480、HT-29细胞中，由空白对照组-低浓度-高浓度阿司匹林组，CD44蛋白印记条带颜色均是由深至浅（图3）。SW-480细胞实验组中CD44蛋白的校准值（CD44蛋白的积分光密度值/β-actin蛋白的积分光密度值）分别为1.31850±0.12497、0.987 80±0.143 99、0.738 00±0.134 07，相比较于空白对照组1.618 0±0.1331 2均较低。HT-29细胞中实验组中CD44蛋白的校准值（CD44/β-actin）分别为1.238 50± 0.117 04、1.121 80±0.155 28、0.793 20±0.124 95，相较于空白对照组1.552 3±0.148 37均较低。对照组与不同实验组结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是SW-480、HT-29细胞组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3、4。

图3 Westem blotting检测SW-480、HT-29细胞中不同药物浓度时CD44蛋白的表达

图4 SW-480、HT-29细胞中不同组别CD44蛋白的表达（CD44/β-actin校准值）的比较

3 讨论

结直肠癌的发生发展是一个异常复杂的过程，涉及多基因、多阶段、多因素的影响，肿瘤干细胞理论认为，CSCs是肿瘤的“起始细胞”或“动力细胞”，是恶性肿瘤发生发展、侵袭、转移以及反复复发的源泉，起着关键作用。目前研究认为，结肠癌干细胞可能起源于正常结肠隐窝干细胞，当此类细胞出现功能紊乱，例如自我更新、分化、克隆增殖和凋亡失去平衡[7]，可能直接或间接导致结直肠癌的发生，这类细胞很有可能就是肿瘤干细胞的最早起源。肿瘤干细胞是肿瘤细胞中含量极少的具有干细胞特性的细胞，能持续自我更新及不断分化出有不同增殖能力的细胞[8]，这可能是肿瘤不断侵袭、转移及复发，传统抗肿瘤治疗无效及放化疗产生耐受的根本原因。CD44通过介导细胞间、细胞与基质间的相互作用，在肿瘤细胞黏附、新生血管形成和肿瘤增殖、侵袭及转移中发挥重要作用[9]，Blacking等[10]在动物细胞中的研究显示，细胞周期中所处的位置与CD44的表达水平与增殖能力紧密相连。目前已有多项研究表明CD44与结直肠癌、胃癌、皮肤癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[11]。研究发现在结肠腺瘤向结肠癌的发展过程中，在K-ras基因突变相关影响下，CD44基因的表达会逐渐上调，甚至比P53等基因的变化还早，证实CD44可作为结直肠肿瘤发生早期检测的重要分子标志物之一。CD44在正常肠黏膜中几乎呈阴性表达，但在结直肠癌或伴不典型增生的腺瘤组织中，其呈局灶状分布于腺管周围，并且在癌组织中的表达与腺瘤组织中的表达均有显著性差异。研究发现，CD44从增生性息肉到腺瘤性息肉表达逐渐上调，尤其在腺瘤性息肉和腺癌组织中表达明显，提示其从正常肠黏膜到腺瘤直至发展到癌的转变过程中可能发挥了关键作用[10]，并且研究发现结直肠癌的淋巴转移、病理分级及Dukes分期都与CD44的表达密切相关[12]。有研究发现CD44阳性的结肠癌细胞裸鼠皮下成瘤实验阳性，而CD44阴性者并不具备动物体内成瘤能力。多项研究已发现CD44分子参与了结直肠癌的发生发展，本实验发现HT-29及SW-480中都明确存在CD44阳性细胞，CD44作为结直肠癌的肿瘤相关干性标记物，可能成为结直肠癌治疗的新靶点。

已有大量研究证实，每天按规定服用阿司匹林或其他非甾体类抗炎药物可有效地预防结直肠癌的发生，降低患癌危险性及癌症病死率，也能降低术后复发率、改善患者生活质量、提高5年生存率等[13]。研究发现阿司匹林的作用与肿瘤的病理类型、临床分期甚至患者服用药物的时间相关，与肿瘤COX-2表达水平也有所关联。Cardwell等[14]的研究发现，明确诊断患结直肠癌后每天服用阿司匹林能够改善患者的预后，提高患者生存率，特别是针对COX-2过度表达的原发性肿瘤患者，但是诊断前服用与预后改善却无明显相关性。所以NSAIDs是如何预防、治疗癌症的机制目前尚不十分清楚，CD44作为结肠癌的干性标记物，与阿司匹林预防结肠癌的作用是否相关尚不明确。本实验结果显示，在结肠癌细胞SW-480和HT-29细胞中，CD44蛋白的表达随着阿司匹林药物浓度的不断增加呈明显逐级下降趋势，并具有明显的药物浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），这表明阿司匹林预防结直肠癌的作用可能是通过抑制CD44蛋白的表达从而抑制细胞中肿瘤干细胞的分化及增殖。因癌组织中COX-2的mRNA和蛋白质的表达可显著升高，故普遍认为阿司匹林的预防作用是因为NSAIDs能够抑制环氧化酶（COXs）的合成，从而减少花生四烯酸转化为前列腺素，在极大部分的结直肠癌及癌前病变组织中可检测到COX-2的高表达，所以大部分研究认为NSAIDs是通过抑制COX-2表达，从而阻断癌细胞的分化增殖、迁移，但选择性COX-2抑制剂能够阻碍Wnt/ β-catenin信号通路是通过诱导TCFs降解的原因，但却不依赖COX-2途径[15]。本实验中CD44的表达在SW-480（COX-2阴性表达）及HT-29（COX-2高表达）2种细胞组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明阿司匹林抗大肠肿瘤的机制并非仅仅涉及COX-2途径，可能也与非COX-2途径密切相关。有研究发现，阿司匹林对COX-2高表达的结肠腺瘤患者无明显作用，却可降低低表达COX-2患者的复发率。NSAIDs可以抑制阴性表达COX-2的肿瘤细胞系SW-480、HCT116细胞的增殖，Nath等[16]证实，NSAIDs可以阻断Wnt/β-catenin信号传导途径，从而抑制非雄激素依赖性前列腺癌细胞的增殖；另外，阿司匹林可抑制胚胎纤维原细胞的生长，而该细胞并不表达COX-2基因。在不同药物浓度的阿司匹林影响后，在COX-2阴性和阳性表达的细胞中都能检测到肿瘤干细胞标记物CD44的降低，且均有量效关系。所以研究认为非甾体类抗炎药物是通过多种信号传导通路对结直肠癌产生的预防治疗作用，其中非COXs依赖途径是主要的通路之一，根据实验结果推测可能是通过抑制CD44肿瘤干细胞标记物的表达，从而抑制肿瘤细胞生长增殖，从而达到预防甚至治疗结直肠癌的作用。但关于阿司匹林预防结肠癌发生发展与CD44相关通路的具体机制仍需要进一步的研究。

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Treatment with aspirin inhibiting the expression of tumor stem marker CD44 in human colorectal cancer cells

Lu Shengnian，Liao Yongmei，Zhao Kui
（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To investigate the effects of aspirin affected by changes in the concentration of different drugs on CD44，which was supposed to be the marker of tumor stem cells in colon cancer cell line SW-480 and HT-29 so as to explore how to prevent the occurrence of colorectal cancer with aspirin.Methods The expression of CD44 in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29 cells was observed by laser scanning confocal microscopy and immunofluorescence double staining.The expression of CD44 protein in human colon cancer SW480（negative expression of COX-2）and HT-29（high expression of COX-2）cells with aspirin at different concentrations（0，2.5，5.0，10.0 mmol/L，namely the control group，the low-concentration group，the middleconcentration group and the high-concentration group）were detected by Western blotting.Results CD44+cells existed the SW-480 and HT-29 cells.There were statistical significance fluorescence value expressed by two kinds of cells.The difference had statistical significance（P<0.05）.Asprin could inhibit the expression of colon cancer cell line SW-480 and HT-29 by Western blotting，which showed an obvious dose-effect relationship（P<0.05）.There were no statistical significance in difference between the two kinds of cells（P＞0.05）.Conclusion CD44+cells exist in the SW-480 and HT-29 cells.Aspirin may inhibit the expression of CD44 protein，the tumor stem maker in the colon cancer cell line SW-480 and HT-29，which was supposed to be acted by COX-2 and non COX-2 pathways.Asprin is probably one of factors to prevent colorectal cancer.

Aspirin；Colonic neoplasms；Neoplastic stem cells；CD44 protein

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.002

A

1009-5519（2015）03-0323-03

2014-11-02）

贵州省高层次人才科研条件特助经费资助项目（TZJF-2011-32）。

鲁生念（1988-），女，贵州遵义人，硕士研究生，主要从事消化系统课题的研究；E-mail：780583556@qq.com。

赵逵（E-mail：kuizhao95868@MSN.com）。