硝酸镓对卵巢癌细胞蛋白表达的影响

杨红梅王学哲

硝酸镓对卵巢癌细胞蛋白表达的影响

杨红梅①王学哲②

目的：通过硝酸镓对卵巢癌HO-8910细胞作用，分析诱导凋亡中对Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的情况。方法：通过对卵巢癌HO-8910细胞培养及干预，Western印迹检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果：硝酸镓组、顺铂组及联合治疗组HO-8910细胞Bcl-2的水平明显低于空白对照组，硝酸镓组、联合治疗组Bax、Caspase-3的水平明显高于空白对照组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：硝酸镓对卵巢癌细胞的作用，可能与Bcl-2的表达水平下调，Bax、Caspase上调有关。

硝酸镓； 卵巢癌细胞； 蛋白表达

卵巢癌是妇科常见肿瘤之一，术后化疗是常用方法，镓是继铂金属类药物之后第二个用于肿瘤治疗的药物。虽然在骨质疏松方面有应用[1-5]，但在肿瘤方面尚未广泛应用于临床，国内外少见报道。本研究通过硝酸镓、顺铂单药及联合用药组分别以不同浓度体外作用卵巢癌HO-8910细胞，探讨硝酸镓作用机制，为肿瘤治疗及制备抗肿瘤药物提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料 硝酸镓（Betapharma有限公司，上海，中国）；顺铂注射液（齐鲁制药有限公司）。人卵巢癌HO-8910细胞株（中国医学科学院肿瘤研究所）。

1.2 细胞培养 将卵巢癌HO-8910细胞株复苏、传代、培养，选择对数生长期的细胞应用。

1.3 实验分组 分成空白对照组、硝酸镓组、顺铂组及硝酸镓与顺铂联合治疗组。取处于对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化制备成单细胞悬液，调整密度为1×105/mL，接种到96孔培养板中，每孔接种100 μL。

1.4 蛋白的表达检测 Western印迹法：将空白对照组和处理组（终浓度为：10 μg/mL的硝酸镓，10 μg/mL的顺铂，5 μg硝酸镓+10 μg顺铂/mL的联合组作用72 h后，空白对照组加入RPMI 1640培养基，设3个复孔。）的细胞PBS清洗3次，加入裂解液（β巯基乙醇），冰上冷却后，12 000 rpm离心2 min，取上清液，以Bradford方法在595 nm波长下测定。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜切胶：根据实验需要按照蛋白的分子量，以Marker为对照进行切胶。将切好的胶置于转胶缓冲液中室温摇晃平衡30 min。备膜：裁剪硝酸纤维素膜和滤纸，与胶的大小相当但略大。戴手套切滤纸和膜。将切好的硝酸纤维素膜置于甲醇中放置15 s，使之从不透明变透明，然后放入超纯水中2 min，最后将处理好的硝酸纤维素膜放入转膜缓冲液中平衡15 min。装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面（负极）保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。浸泡好的滤纸，随后按照凝胶→硝酸纤维素膜→滤纸→海绵垫的顺序依次叠放，注意每一层都不能有气泡（如有气泡可用玻璃棒轻轻擀压）。最后将白色板（正极）盖好装入转膜槽中。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的周围放置冰来降温。本实验室使用220 mA转膜2 h。转完后将膜取下硝酸纤维素膜，标记一角。封闭（将膜用TBST中漂洗3次，每次5 min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入加有BSA封闭液的平皿中，室温下摇床2 h）。加一抗：将封闭后的硝酸纤维素膜放至含有TBST的洗缸中，摇床上漂洗3次，每次5 min。洗完后分别加入Bax抗体（1∶300）、Caspases-3（1∶150）、Bcl-2（1∶300）抗体及β-actin抗体（1∶1000），放入平皿中在侧摆摇床上，室温低速孵育2 h；加二抗：回收一抗，将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3次，每次5 min，然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放至加有辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶800）的平皿中，室温避光孵育1 h。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中漂洗3次，每次5 min；化学发光，显影，定影；凝胶图像分析，采用Image J软件分析处理。

1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料用（±s）表示，两组比较采用作独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Western结果进行计算机图像分析，见表1、图1。硝酸镓组、顺铂组及联合治疗组HO-8910细胞Bcl-2的水平明显低于空白对照组；Bax、Caspase-3的水平硝酸镓组、联合治疗组明显高于空白对照组，比较差异有统计学意义（P＜0.05），而顺铂作用细胞Bax、Caspase表达变化不显著。

表1 硝酸镓作用72 h后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达结果（±s）

表1 硝酸镓作用72 h后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达结果（±s）

*与空白对照组比较，P＜0.05；#与顺铂组比较，P＜0.05

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图1 各组蛋白表达注：1：空白对照组；2：顺铂组；3：硝酸镓组；4：联合治疗组

3 讨论

早期，人们将放射性镓用于对肿瘤的定位及检测肿瘤细胞生长代谢的活性。2004年美国FDA已审批硝酸镓注射液作为non.Hodgkin的淋巴癌治疗的Ⅱ期临床。镓是继铂金属类药物之后第二个用于肿瘤治疗的药物，但它比顺铂类药物疗效显著且毒性小[6-9]，能有效地治疗某些癌症[10-11]。人们逐渐认识到镓的化疗作用远远超出镓对肿瘤的定位。且相关药物已经进入临床研究。

目前认为镓可能抗癌机制主要包括转铁蛋白受体途径，研究发现在部分恶性淋巴瘤和膀胱癌中转铁蛋白受体表达增高，硝酸镓对于这种类型的肿瘤的治疗效果明显可能是通过转铁蛋白受体途径抑制了转铁蛋白受体的活性，阻止铁进入细胞，致细胞内铁缺乏而导致核糖核苷酸还原酶铁依赖M2亚单位活性降低，抑制了细胞内相关基因的表达[12-13]。

近年来，有关细胞凋亡在肿瘤发生，发展中的作用越来越受到重视细胞凋亡又称细胞程序性死亡，肿瘤的发生与控制细胞增殖的癌基因的过度表达有关，也与抑制细胞凋亡基因的高表达及诱导细胞凋亡的抗癌基因变异失活有关细胞凋亡机制被不适当地终止是细胞癌变的重要前提，凋亡过程的受抑对肿瘤的发生发展起重要作用，Caspase-3，Bax及Bcl-2是与癌发生及预后密切相关的3个指标，Bcl-2基因是人体最主要的抗凋亡基因。它编码的Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等处。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有：（1）拮抗促凋亡基因bax；（2）抑制促凋亡的蛋白质细胞色素c自线粒体释放到胞质；（3）阻止胞质中的细胞色素c激活caspase；（4）有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用；Bax基因属于Bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，Bax是极重要的促细胞凋亡基因一；Caspase-3通常以非活化的酶原形式存在于细胞中，只有当细胞凋亡时才被激活。活化的Caspase-3蛋白能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复相关的蛋白或激酶失活，是引发凋亡的蛋白酶级联反应中的核心蛋白酶[14]。所以，本次研究通过硝酸镓体外作用卵巢癌HO-8910细胞，观察三者蛋白水平表达变化，在分子层面分析镓与肿瘤细胞的关系。

最新的研究发现镓能够引起淋巴瘤细胞凋亡是通过内在的线粒体途径。镓通过激活Bax，破坏线粒体膜，释放细胞色素C，进一步激活caspase-3[15-16]，进而影响下游基因的表达，抑制肿瘤细胞生长繁殖。本实验重点在此途径进行研究。

Western结果显示，与正常对照组比较，硝酸镓与顺铂对卵巢癌细胞在Bax、Caspase蛋白水平表达方面比较差异有统计学意义（P＜0.05），Western灰度值分别是Bax（0.5100±0.0022/0.4300±0.0011）、Caspase（0.3400±0.0016/0.2100±0.0003）；顺铂作用细胞Bax、Caspase表达变化不显著，Western灰度值分别是Bax（0.4300±0.0011/0.4200±0.0021）、Caspase（0.2100±0.0003/0.2000±0.0013）而硝酸镓组变化明显，提示硝酸镓可能通过激活Bax，破坏线粒体膜，释放细胞色素C，进一步激活caspase-3的线粒体途径方式诱导细胞凋亡，由于未做线粒体相关的其他实验，此作用效应还需进一步明确。顺铂非此通路作用，还可能与癌细胞本身此蛋白表达过低有关。

通过相关实验以表明硝酸镓在体外对HO-8910细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，本实验在硝酸镓作用下，卵巢癌细胞下调Bcl-2、上调Bax蛋白，活化Caspase可能是其诱导细胞凋亡机制之一。

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Effects of Gallium Nitrate on Protein Expression of Ovarian Cancer Cells

YANG Hong-mei， WANG Xuezhe.//Medical Innovation of China，2015，12（07）：025-027

Objective： To assess effect on ovarian adenocarcinoma cell HO-8910 by gallium nitrate， investigate the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3. Method： The human ovarian cancer cell line HO-8910 was cultured and treated with drugs， expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 was analyzed by Western blot. Result： The expression of Bcl-2 protein was down regulated in gallium nitrate group， cisplatin group and combination group compare with control. Bax and aspase-3 protein was activated in gallium nitrate group and combination group compare with control. Conclusion： Effects of gallium nitrate on human ovarian cancer cells， may be associating with the expression of Bcl-2 levels is decrease， Bax， Caspase are up regulation.

Gallium nitrate； Ovarian cancer cells； Expression of protein

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.008

2014-11-04） （本文编辑：王宇）

①辽宁省锦州市太和区医院 辽宁 锦州 121001

②辽宁医学院附属第一医院

王学哲

First-author’s address： Taihe District Hospital of J inzhou City， J inzhou 121001， China