牛奶中β-内酰胺酶来源及其检测方法研究进展

陈美霞 ，文芳 ，郑楠 ，杨晋辉 ，张勇 ，陈璐

（1.农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），北京100193；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193）

0 引言

近些年，牛奶抗生素残留成为奶及奶制品质量安全的一个重点问题。因为β-内酰胺酶可使β-内酰胺类抗生素降解，导致空间结构破坏或功能丧失，从而可避免牛奶中残留抗生素的检出[1]。因此，不法商家人为地向奶中添加β-内酰胺酶使抗生素降解，避免抗生素的检出。β-内酰胺酶的添加不仅掩盖了抗生素残留的事实，同时引入了抗生素降解产物及β-内酰胺酶残留所带来的风险[2]。为了规范奶产品安全生产及奶制品质量安全，我国已将β-内酰胺酶列入非食用添加剂名单并要求进行全国监测。本文从牛奶中β-内酰胺酶残留的原因、现状、风险及检测方法等方面进行综述，为β-内酰胺酶研究提供参考。

1 β-内酰胺酶结构与功能

β-内酰胺酶，英文名称为β-Lactamase，是细菌代谢过程产生的一种蛋白质，可特异性分解β-内酰胺类抗生素。目前发现并报道的β-内酰胺酶有200多种。根据β-内酰胺酶的等电点、结构、水解产物、是否受克拉维酸抑制等，可以将β-内酰胺酶分为五大类：（I）CEP-N 酶（头孢菌素酶），（II）PEN-Y 酶（青霉素酶），（III）BSD-Y 酶（广谱酶），（IV）EBS-Y 酶即 ESBLS（超广谱酶），（V）金属酶（金属β-内酰胺酶）[3]。β-内酰胺酶对抗生素的作用主要有水解和非水解两种方式[4]。大多数β-内酰胺酶的活性位点具有一个纵行沟状结构，该结构疏松易弯曲，利于底物的结合。抗生素β-内酰胺环上的羰基碳可以不可逆的结合在该活性位点处的丝氨酸上，使抗生素β-内酰胺环解开，造成抗生素降解，避免抗生素的检出。另外一些抗生素如金属酶，它们是利用二价金属离子与组氨酸或半胱氨酸结合，并与抗生素羰基中的酰胺键相互作用，抑制抗生素发挥作用，避免抗生素的检出。目前国际上研究比较活跃的是超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶。

2 β-内酰胺酶残留的风险

2.1 β-内酰胺酶在牛奶中残留的内源性因素

研究表明，许多微生物可以产生β-内酰胺酶[5]。其中，革兰氏阳性菌可以产生青霉素酶和头孢素酶2种β-内酰胺酶；而革兰氏阴性菌产生的β-内酰胺酶却种类繁多，截至目前，已报道有200多种。目前关于牛体内或牛奶内产β-内酰胺酶的微生物是否会造成牛奶中β-内酰胺酶残留主要存在以下两种观点。

高延玲等[6]及谢磊等[7]认为微生物产生的β-内酰胺酶在牛奶中残留率比较高。2010年高延玲等[6]在已查明无人为β-内酰胺酶添加的情况下对140批生鲜乳进行检测，β-内酰胺酶检出率达52.9%。与之类似，2014年谢磊等[7]对北京市10家养殖场的593份生鲜乳进行分析，内源性β-内酰胺酶残留阳性检出率达28.7%。这可能与贮存时间延长、抗菌药物不合理使用等因素促进细菌产β-内酰胺酶增加有关[6-7]。

然而，张鑫潇等[2]及刘琴等[8]认为在无外源β-内酰胺酶添加的情况下，微生物产生的β-内酰胺酶残留量及残留率很低，几乎无法检测到。他们分析可能是牛奶采集方式、牛奶成分、消毒方法、包装储存方式等情况不适合产β-内酰胺酶的微生物生存。因此，张鑫潇等[2]及刘琴[8]等认为基于目前的认识和实践，牛奶中检出的β-内酰胺酶是外源性添加的。

2.2 β-内酰胺酶在牛奶中残留的外源性因素

β-内酰胺类抗生素因其抗菌谱广、价格便宜广泛应用于畜牧生产中，如治疗乳房炎及其他细菌感染等疾病[9-11]。但是由于使用不当，如滥用、误用尤其是不按说明经过休药期处理等原因，出现了牛奶中抗生素残留的问题[12-13]。由于抗生素存在的普遍性，国家出台相应法规要求牛奶中抗生素“不得检出”，并要求对所有生鲜乳进行抗生素含量检测，超标者不得出售。因此，不法商家便在牛奶中添加抗生素降解剂，避免“有抗奶”的检出。崔生辉等[14]、Guay等[15]通过实验证明这些“抗生素分解剂”的主要成分正是β-内酰胺酶。另外，由于国内大多数乳品企业对抗生素超标的牛奶采用降价收购的政策，使得1吨“有抗奶”和“无抗奶”价格相差近千元。在利益的驱动下，不法商家会在牛奶中添加抗生素降解剂生产人造“无抗奶”[1]，从而导致牛奶中β-内酰胺酶的残留。同时，随着科学技术的发展，纯化β-内酰胺酶的工艺已经非常成熟，目前具有一定生产规模的β-内酰胺酶生产厂家不少于30家[2]。

虽然微生物可以产生β-内酰胺酶，可能在牛奶中残留。但是，目前对市场和消费者危害最大的并不是内源性β-内酰胺酶，而是人为添加的β-内酰胺酶。甚至有人认为，正是这些外源性降解剂的添加使得假“无抗奶”大量充斥市场。

2.3 牛奶中β-内酰胺酶残留的风险

虽然目前还没有关于β-内酰胺酶残留实际危害的报道，但是，牛奶中残留的β-内酰胺酶对人体健康及奶业健康发展而言存在一定的风险。

以青霉素为例，约74%的病人对其过敏。究其机理，一方面，青霉素降解产物——青霉素噻唑酸可与蛋白结合形成抗原导致过敏；另一方面，青霉素在内部β-内酰胺环开环后会高度聚合形成高聚物导致过敏[2]。而郭宗儒等[16]及彭司勋等[17]指出，β-内酰胺酶可催化青霉素开环生成青霉素噻唑酸。因此，从原理上讲，β-内酰胺酶有引起人体过敏的风险。另外，因为β-内酰胺酶分解其他β-内酰胺类抗生素的降解产物中有许多是抗生素的类似物，而其分解物的危害尚不清楚，因此长期饮用含β-内酰胺酶处理的牛奶，也存在使人产生耐药性、降低对传染病的抵抗能力的风险[2]。另外，滥用解抗剂可能会引入其他的致病菌、致癌物质，长期饮用解抗剂处理的奶对身体的伤害不言而喻。

同时，不法商家添加以β-内酰胺酶为主要成分的解抗剂来掩盖抗生素使用的事实，扰乱市场，不利于我国奶业的健康可持续发展。

2.4 β-内酰胺酶在牛奶中的残留现状

2007年崔生辉等[14,18]对市售的38份牛奶样品进行检测，60%以上样品呈β-内酰胺酶阳性。2010年高延玲等[6]对42个奶牛养殖场和养殖小区的140批生鲜乳进行检测，β-内酰胺酶检出率达52.9%。2012年宁波市公布的《2012年下半年宁波市乳制品评价性抽检结果通报》中显示该市出入境检验检疫局检验检疫技术中心对608批次奶及奶制品进行检测，β-内酰胺酶呈阳性的达40批次。2013年农业部对西部地区某省异地抽检时发现12份样品中唯一一份不合格的原因便是β-内酰胺酶超标[19]。2014年谢磊等[7]对北京市10家养殖场共计593份生鲜乳进行检测，有28.7%的样品呈β-内酰胺酶阳性。

不管这些检出的β-内酰胺酶是内源性还是外源性造成的，如此高的检出率足以说明牛奶中β-内酰胺酶残留的严重性，说明β-内酰胺酶的问题不容小觑。这警示我们需要加强牛场牛奶卫生、运输以及储存、市场销售流通等各环节的管理，减少牛奶中β-内酰胺酶的残留。

3 β-内酰胺酶主要检测方法

3.1 微生物法

微生物法是在实验室检测β-内酰胺酶使用比较广泛、发展最早的一种方法。它的原理是选择对抗生素敏感的细菌为指示剂，根据抑菌圈的大小判断酶的多少。主要有显色培养法[20]、三维试验法[21]、纸皮扩散法[22]、聚合酶链式反应法[23]、杯碟法[24]等。其中最为常用的是杯碟法（表1）。

2014年李欣南等[28]针对微生物法检测β-内酰胺酶中常用的杯碟法的操作要点及注意事项进行了梳理，为实际检测工作提供参考。

虽然目前实验室中微生物法使用比较广泛，但费时费力，不适合现场及快速检测工作。

3.2 碘量法

碘量法也是目前比较常用的一种检测方法。它是基于β-内酰胺酶分解抗生素后的降解产物与碘发生氧化还原反应进行β-内酰胺酶检测的方法。中华人民共国药典（2005版）中推荐使用碘量法对青霉素酶活性进行检测[29]。同时，目前市场上许多快速检测试剂盒也是基于碘量法进行的设计。

Sykes等[30]和Novick等[31]利用碘量法对β-内酰胺酶进行检测，根据15～20 min后酶将抗生素完全降解后产生的吸光度值的变化进行β-内酰胺酶的定量，该方法检测限为0.001 U。基于碘量法开发的优尔齐TMβ-内酰胺酶残留定性及定量检测试剂盒，定量检测限为1 U/mL，借助酶标仪30 min内即可出检测结果[32]。张鑫潇等发现碘量法可用于生鲜奶及奶制品中β-内酰胺酶的检测，但是检测限比较高[2]。2010年谢岩黎等[33]的研究表明当β-内酰胺酶浓度大于30 U/mL时，可通过直接碘量法对β-内酰胺酶进行定性分析，通过间接滴定法进行定量分析。

表1 杯碟法在检测牛奶中β-内酰胺酶的应用

碘量法在β-内酰胺酶检测工作中使用比较广泛，目前也有几款基于碘量法检测β-内酰胺酶的试剂盒面市，适合进行现场及大批量筛选工作；但是某些方法检测限较高，需降低检测限，提高灵敏度。

3.3 酸定量法

酸定量法的原理是β-内酰胺类抗生素在β-内酰胺酶的作用下分解，生成酸性产物引起牛奶pH发生变化，使相应指示剂变色或使碳酸盐溶液释放二氧化碳引起压力变化，通过pH计测量牛奶pH变化、观察指示剂变色或压力测量计测定压力变化等手段实现对牛奶中β-内酰胺酶的定量。

1947年Henry等[34]利用青霉素酶分解青霉素产生酸性产物青霉素噻唑酸引起二氧化碳释放导致压力变化的原理，通过压力测量计定量二氧化碳的变化实现对β-内酰胺酶的定量检测。2005年张春辉等[35]以酚酞为指示剂，通过酸定量法对产β-内酰胺酶的菌株进行选择，阳性率达97%。朱融融等[36]通过双pH计同时检测建立了牛奶中青霉素酶的检测方法，检出线性范围为0.5～3.5 U，检出限为0.4 U。2009年马洁等[37]通过利用酸度计检测牛奶pH的变化,实现对β-内酰胺酶的定量，该方法在牛奶中的检测限为15 U/mL，同时得到β-内酰胺酶米氏常数为0.0351 mmol/L。

根据压力变化测定β-内酰胺酶的酸定量法因费时较长、操作复杂、影响因素较多、所需设备复杂等原因在实际中很少用到；而用pH计测定的方法操作简便，结果重复性也比较好，但是可能会出现假阳性和假阴性的情况。因此，酸定量法在实际检测工作中使用并不广泛。

3.4 头孢菌素显色法

头孢菌素显色法原理是显色头孢菌素在β-内酰胺酶的作用下解环降解，颜色发生改变表征β-内酰胺酶的存在及含量。

1972年Callaghan等[38]结合其之前（1967）[39]的实验方法，选择头孢硝噻吩为显色头孢菌素，通过检测颜色的变化定性、定量多种材料中的β-内酰胺酶。其中定性方法方便易行，可在1 min内判断结果；定量方法用紫外分光光度计就可以完成，检出限为10 μg/mL。但是该方法可能会因头孢硝噻吩与蛋白结合，导致假阳性结果出现。1980年Schindler等[40]发现4-2-吡啶偶氮-N，N-二甲氧基苯胺（PADAC）可以用于检测β-内酰胺酶实现对产该酶菌株的选择，并可实现对β-内酰胺酶抑制剂的分析。1982年Jorgensen[41]等以PADAC为显色头孢菌素，通过检测β-内酰胺酶进行产β-内酰胺酶菌株的选择，发现PADAC可以有效的用于嗜血杆菌和淋球菌产生的大量Ⅲ型β-内酰胺酶检测，但是对肠杆菌、克雷伯氏菌、拟杆菌及葡萄球菌产生的β-内酰胺酶检测不灵敏，而头孢硝噻吩对后者产生的β-内酰胺酶检测更为灵敏。1987年Guay[15]等发现氯汞苯甲酸（pCMB）可以屏蔽牛奶中內源性的β-内酰胺酶，并用PADAC作为显色头孢菌素。因为PADAC不与蛋白质结合，所以可以实现对β-内酰胺酶更加灵敏的检测。另外,2010年陈号等[42]通过重复Callaghan等（1972）的实验方法发现20 min内可实现对牛奶中20 U/mLβ-内酰胺酶的检测，但是，定量方法没有重复出来。

虽然用头孢菌素显色法检测β-内酰胺酶的研究及报道较早，但是因该方法需要使用特殊的头孢菌素，价格比较昂贵，所以在实验室中使用频率不高。

3.5 现代仪器检测法

高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法等因其分离效率高、分析速度快、适用范围广等优点，目前广泛应用于食品中危害因子的检测，并有许多危害物质检测的国家标准陆续出台。

2008年林楠等[43]利用高效液相色谱仪检测牛奶中青霉素被β-内酰胺酶降解的产物青霉素噻唑酸，以此来判断β-内酰胺酶的存在与含量，在牛奶中的检测限为4 U/mL，只需30 min即可出检测结果。2009年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》中关于β-内酰胺酶的检测，中国检验检疫科学院食品安全所推荐使用液相色谱法。同年，韩奕奕等[44]对β-内酰胺酶进行检测，实验表明，SNAP双流向酶联免疫间接检测法对β-内酰胺酶加标试样的检出限可以达到0.001 IU/mL。2010年孙汉文等[45]利用快速高分离液相色谱-串联质谱（RRLC-MS/MS）检测添加β-内酰胺酶后氨苄青霉素的酶解率实现对β-内酰胺酶的定性和定量，牛奶中检测限为4 U/mL。2010年Xu等[46]开发了一种依赖基质辅助激光解吸/电离傅立叶变换质谱（MALDI-FTMS）的β-内酰胺酶检测方法，该法是通过检测青霉素被β-内酰胺酶降解后的产物青霉素噻唑酸来实现对β-内酰胺酶的定量。牛奶中检测限为0.006 U/mL。2015年Zhou等[47]开发了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的HPLC方法，该法通过HPLC检测与β-内酰胺酶孵育后剩余的青霉素G的量间接实现对β-内酰胺酶的定量及活性检测，牛奶中检测限为0.6 U/mL。

现代仪器检测法可对β-内酰胺酶进行高通量定量检测，故常可用于实验室定量分析，但是因为需要专门人员进行操作、前处理比较复杂、所需设备比较昂贵等原因，在一些小实验室使用频率不高，且不适用于现场检测。

3.6 生物传感器法

生物传感器由生物活性物质（如核酸、抗原、抗体、酶、完整细胞等等）构成的生物功能敏感原件，配合适当的信号转换器组合而成。工作原理是待测物质进入生物传感器并与之部分或全部原件发生反应，产生一定的物理信号（如颜色、电、热、光等）经特定方法或转化器转换成可定量或可处理的信号，实现对目标物质的定性或定量。

2007年Liu等[48]利用纳米金材料设计了一种检测β-内酰胺酶的传感器，可利用比色法实时检测β-内酰胺酶的活性。2010年Rubtsova等[49]开发了一种基于辣根过氧化酶设计的寡核苷酸微阵列，可用于临床光谱β-内酰胺酶的常规检测。2013年Zhou等[50]开发了一种检测β-内酰胺酶的温度生物传感器，该传感器的原理是加入定量的青霉素G与β-内酰胺酶孵育，取混合液注入温度传感器系统中，根据温度变化得出青霉素G的量，最后根据未反应的青霉素G的量实现对β-内酰胺酶的定量。该方法检测限为1.1 U/mL。2014年Li等[51]开发了一种检测β-内酰胺酶的近红外荧光探针，该探针是将特定的头孢菌毒固定在半菁骨架上制作而成，该探针本身信号很弱，但在β-内酰胺存在的情况下与之反应，释放荧光基团使信号显著升高，根据信号变化实现对β-内酰胺酶的定量，该方法在牛奶中检测限为0.02 nmol/L。

生物传感器通常具有体积小、灵敏度高、选择性强、抗干扰能力强、响应快及可重复使用等优点，因此近些年研究较热。目前已有多款基于传感器原理设计的试剂盒或试纸条面市，可实现对牛奶中β-内酰胺酶的检测。

3.7 其他

1996年Liang等[52]在研究β-内酰胺类抗生素时指出可以利用电化学发光方法检测生物基质中的β-内酰胺酶。2002年Hujer[53]等通过构建对SHV-1和CMY-2型β-内酰胺酶特异性的多克隆抗体进行酶联免疫分析（ELISAs），发现该方法至少可以对95%的SHV及AmpC型β-内酰胺酶实现灵敏、特异性地检测，并可以对实验室及临床分离出的β-内酰胺酶实现相对定量分析。2009年河南省兽药监察所发明了一种生鲜奶及奶制品中β-内酰胺酶检测试剂盒，可实现快速检测[54]。2013年Wang[55]等基于最优化的单克隆抗体开发了一种检测β-内酰胺酶的双抗体酶联免疫方法，在牛奶中检测限达4.17 ng/mL。

虽然这些方法没有具体分类且使用频率不高，但仍可以用于β-内酰胺酶的检测。并且这些方法可以与其他方法结合，有望生产出适合现场检测的快速、高灵敏检测产品。

4 结束语

目前针对牛奶中β-内酰胺酶的检测方法有许多，如微生物法、碘量法、酸定量法、头孢菌素显色法、现代仪器检测法、生物传感器法及其它法等。但没有一款集灵敏度、便携性、高通量、易操作、经济于一身的方法，更没有一款这样的产品面市。另外，目前绝大多数方法是基于牛奶中总的β-内酰胺酶检测，无法区分内、外源β-内酰胺酶。因此，建立一种可区分内、外源性β内酰胺酶，同时又可高通量、高灵敏的、方便快捷的β-内酰胺酶检测技术具有重要意义。

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